Isolierung von Hirngefäßen von Mäusen: Ein Protokoll zur Isolierung intakter Gefäße aus einer Gehirnprobe von Mäusen

Die Hirngefäße sind von einer Schicht eng miteinander verbundener Endothelzellen umgeben. Diese Zellen sind von einer Basalmembran umgeben, zusammen mit zellulären Komponenten wie Perizyten und Astrozyten.

Um Gehirngefäße von umgebenden Neuronen und Gliazellen zu isolieren, nehmen Sie ein Becherglas mit Mäusegehirn, das in einen Homogenisierungspuffer getaucht ist. In kleine Stücke hacken. Homogenisieren Sie das Gehirngewebe, um es zu dissoziieren und Neuronen, Gliazellen und Gehirngefäße freizusetzen. Diese Behandlung stört auch die Myelinscheide, die die Neuronen umgibt.

Füllen Sie das Homogenat in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie es, um die Gefäße zu pelletieren. Die leichteren Bestandteile wie Neuronen und Gliazellen verbleiben im Überstand, während das Myelin eine dichte Grenzschicht bildet, die das Pellet umgibt.

Der Überstand wird verworfen und das Gefäßpellet mit der angehängten Myelinschicht in einem geeigneten Dichtegradientenmedium resuspendiert. Zentrifugieren Sie, um die Gefäße zu pelletieren, und erhalten Sie ein Band aus fettreichem Myelin, das an der Oberseite des Überstands schwimmt. Entfernen Sie das Myelinband zusammen mit dem verbrauchten Medium und suspendieren Sie das Pellet in einem frischen Puffer.

Die Vorbereitung des Rohölbehälters wird mit einer Filteranordnung abgeseiht, die einen Filter enthält, der klein genug ist, dass die Behälter nicht hindurchpassen können. Den Filter in ein frisches Becherglas mit Pufferlösung umfüllen. Kratzen Sie vorsichtig das Filterpapier ab, um die Gefäße zu lösen und für die weitere Analyse aufzubewahren.

Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut vom Hals der Maus bis zur Nase einzuschneiden und die Haut nach hinten zu ziehen. Waschen Sie den Schädel mit PBS, um alle kontaminierenden Haare zu entfernen, und führen Sie dann eine Schere in den Schädel ein, vor den Riechkolben. Öffnen Sie die Schere, um den Schädel in zwei Teile zu brechen, und entfernen Sie das Gehirn mit einem Spatel.

Als nächstes präparieren Sie den Plexus choroideus aus den Seitenventrikeln und übertragen das Gehirn in ein 150-Milliliter-Becherglas mit 20 Millilitern B1-Lösung auf Eis. Schneiden Sie dann mit zwei Skalpellen das Gehirn kräftig in 2-Millimeter-Gewebefragmente und verwenden Sie einen automatisierten Dounce-Homogenisator, um das Gewebe für 20 Schläge bei 400 U/min auf Eis zu homogenisieren.

Zur Reinigung der Gefäße wird das Homogenat in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführt und der Gewebebrei in einer Schwingrotorzentrifuge heruntergeschleudert. Auf der Oberseite des Gefäßpellets bildet sich eine große weiße Grenzfläche, die hauptsächlich aus Myelin besteht. Entsorgen Sie den Überstand.

Fügen Sie 20 Milliliter eiskalte B2-Lösung hinzu und schütteln Sie das Röhrchen 1 Minute lang kräftig. Nach einer zweiten Zentrifugation bildet das Myelin eine dichte weiße Schicht an der Oberfläche des Überstands. Drehen Sie das Röhrchen langsam, damit die B2-Lösung beim Ausgießen an der Wand entlanglaufen kann, und entsorgen Sie das Myelin mit dem Überstand.

Verwenden Sie dann eine in saugfähiges Papier eingewickelte Plastikpipette, um alle Flüssigkeitsreste von den Wänden des Röhrchens zu entfernen, achten Sie darauf, das Gefäßpellet nicht zu berühren, und drehen Sie das Röhrchen auf Eis auf den Kopf. Anschließend das Pellet in 1 Milliliter eiskalter B3-Lösung resuspendieren, gefolgt von der Zugabe von weiteren 5 Millilitern B3-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass die Gefäße keine Aggregate bilden.

Setzen Sie nun einen 20-Mikron-Nylon-Netzfilter auf einen Becker-Kolben und äquilibrieren Sie den Filter mit 10 Millilitern eiskalter B3-Lösung. Gießen Sie die Gefäßvorbereitung auf den Filter und spülen Sie die Gefäße vorsichtig mit weiteren 40 Millilitern eiskalter B3-Lösung aus.

Übertragen Sie dann den Filter sofort mit einer sauberen Pinzette in ein Becherglas mit 30 Millilitern frischer B3-Lösung und befestigen Sie die Gefäße mit leichtem Schütteln am Filter. Gießen Sie den Becherinhalt in ein 50-Milliliter-Plastikröhrchen. Nach einer Zentrifugation wird das Pellet in 1 Milliliter eiskalter B3-Lösung wieder suspendiert.