Kleinhirndissektion und Schnittpräparation: Eine Methode zur Erzeugung von Gewebeschnitten aus Kleinhirn der Maus

Bei Mäusen befindet sich das Kleinhirn an der Basis des Vorderhirns und besteht aus zwei lateralen Hemisphären, die durch eine Mittellinie - Vermis - verbunden sind. Das Kleinhirn, das den Großteil der Neuronen des Gehirns enthält, ist für neurologische Untersuchungen von entscheidender Bedeutung.

Um Kleinhirnscheiben zu erzeugen, beginnen Sie mit einem geköpften Mauskopf. Führen Sie eine Schere in das Foramen magnum ein - die Öffnung an der Schädelbasis. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig ein und entfernen Sie ihn. Klappen Sie als Nächstes das Gehirn aus und durchtrennen Sie den Sehnerv und den Trigeminusnerv. Geben Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben in ein gekühltes Seziermedium. Trennen Sie das Hinterhirn von den anderen Hirnteilen.

Schneiden Sie dann die darunter liegenden Kleinhirnstiele - die Verbindung zwischen Kleinhirn und Hirnstamm - ab, um das Kleinhirn zu lösen. Entfernen Sie die Hirnhäute aus dem Kleinhirn. Platzieren Sie das Kleinhirn vorsichtig auf einer Gewebe-Chopper-Plattform senkrecht zur Chopper-Klinge. Präparieren Sie nun die Gewebescheiben mit entsprechender Dicke. Befeuchten Sie die Scheiben sofort und geben Sie sie zurück in die Petrischale, in der sich das Seziermedium befindet.

Trennen und identifizieren Sie die Scheiben von der Vermis. Übertragen Sie die ausgewählten Scheiben in eine Vertiefung, die in einer Kulturplatte mit einem geeigneten Nährmedium eingesetzt wird. Inkubieren Sie die Kultur, um die strukturelle und funktionelle Integrität der präparierten Kleinhirnschnitte für weitere Experimente zu erhalten.

Führen Sie zunächst eine kleine Schere vorsichtig in das Foramen magnum ein und schneiden Sie den Schädel mit einem seitlichen Schnitt zur Seite und schneiden Sie dann den gesamten Kopfschädel durch. Um den dorsalen Teil des Schädels zu bergen, verwenden Sie eine feine, gerade Pinzette, um den dorsalen Teil des Schädels vorsichtig anzuheben.

Führen Sie dann die Pinzette vorsichtig zwischen dem ventralen Schädel und dem Gehirn ein. Klappen Sie das Gehirn vorsichtig aus und schneiden Sie den Sehnerv und den Trigeminusnerv mit einer kleinen Schere durch. Drehen Sie als Nächstes den Kopf oder den dorsalen Teil des Schädels auf den Kopf, knapp über einer 60-Millimeter-Zellkulturschale mit eiskaltem Dissektionsmedium, um das Gehirn durch die Schwerkraft fallen zu lassen.

Richten Sie das Gehirn mit einer feinen Pinzette mit der dorsalen Seite nach oben und der ventralen Seite nach unten aus. Verwenden Sie unter dem binokularen Mikroskop die feine gerade Pinzette, um das Gehirn auf der Vorderhirnseite zu immobilisieren. Trennen Sie dann das Hinterhirn vom Rest des Gehirns. Schneiden Sie die Kleinhirnstiele unterhalb des Kleinhirns ab, um das Kleinhirn vom Rest des Hinterhirns zu trennen.

Sobald das Kleinhirn isoliert ist, reißen Sie die Hirnhäute vorsichtig mit einer feinen geraden Pinzette ab. Halten Sie das Kleinhirn vorsichtig mit der fein gebogenen Pinzette fest und platzieren Sie es mit der Rückenseite nach oben auf der Kunststoffplattform senkrecht zur Rasierklinge des Choppers. Saugen Sie anschließend mit einer sterilen Pipettenspitze mit dünnem Ende, die an einer 1-Milliliter-Pipette befestigt ist, überschüssiges Dissektionsmedium um das Kleinhirn herum ab. Dann schnitt er mit einem Gewebehacker 300 Mikrometer dicke sagittale Abschnitte des Kleinhirns auf.

Geben Sie anschließend einen Tropfen Seziermedium vorsichtig auf das geschnittene Kleinhirn. Saugen Sie dann mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung, die an der 1-Milliliter-Pipette befestigt ist, das geschnittene Kleinhirn langsam ab und übertragen Sie es zurück in die 60-Millimeter-Zellkulturschale mit eiskaltem Dissektionsmedium.

Trennen Sie anschließend mit zwei feinen geraden Pinzetten die einzelnen Scheiben. Übertragen Sie dann mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung, die an der 1-Milliliter-Pipette befestigt ist, bis zu vier ausgewählte Scheiben aus dem Vermis zusammen mit etwas Seziermedium auf einen Kultureinsatz einer 6-Well-Platte. Entfernen Sie überschüssiges Seziermedium um die Scheiben herum mit einer dünnen Pipettenspitze.