JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 5:43 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie die Elektroporation, indem Sie eine Glaspipette mit der gewünschten Plasmidlösung entnehmen. Befestigen Sie es an einem Mikropipettenhalter, der mit einer Silberdrahtelektrode ausgestattet ist, und stellen Sie sicher, dass die Elektrode in die Mikropipette eingeführt wird. Nehmen Sie eine Elektroporationskammer, in der sich ein ultradünner Hippocampus-Schnitt befindet, der in künstliche Zerebrospinalflüssigkeit getaucht ist.
Tauchen Sie die Masseelektrode in die in der Kammer vorhandene Flüssigkeit ein, um sie anschließend zu elektroporieren. Senken Sie die Pipettenspitze in die Elektroporationskammer ab und notieren Sie den Ausgangswiderstand. Positionieren Sie die Pipettenspitze mit einem Mikroskop in der Nähe der Zielzelle. Sobald die Pipette mit der neuronalen Membran in Kontakt kommt, steigt ihr Widerstand stark an.
Wenden Sie positiven Luftdruck an, um eine kleine Einstülpung in der neuronalen Membran zu erzeugen. Wenden Sie schnell einen leichten Sog an, um die Membran nach oben zu drücken, wodurch eine lose Abdichtung zwischen der Pipettenspitze und der Membran entsteht. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einige Male, um die Membran zu konditionieren und eine Zelllyse zu vermeiden.
Üben Sie nach der Konditionierung einen starken Sog aus, um eine dichte Abdichtung mit einer Membran zu bilden, die als Gigaohm-Dichtung bezeichnet wird. Verwenden Sie elektrische Impulse, um transiente Poren im versiegelten Bereich der Membran zu bilden. Diese Öffnungen erleichtern den Eintritt von Plasmiden in das Zielneuron. Nach der Elektroporation verschließen sich die Poren wieder und schließen Plasmide im Neuron ein.
Um Schnittkulturen für die Elektroporation vorzubereiten, werden die interessierenden Kultureinsätze in einzelne 3-Zentimeter-Petrischalen überführt, die mit 900 Mikrolitern Nährmedium beladen sind, und die Kulturen in einen Kohlendioxid-Inkubator auf dem Tisch gestellt. Anschließend werden frische Kultureinsätze mit 1 Milliliter Scheibenkulturmedium pro Einsatz in einer 3,5 Zentimeter großen Petrischale mindestens 30 Minuten lang vorinkubiert und die Leitungen der Elektroporationsanlage 5 Minuten lang mit 10 % Bleiche sterilisiert.
Am Ende der Perfusion spülen Sie die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit ionisiertem autoklaviertem Wasser, bevor Sie mit filtersterilisiertem aCSF perfundieren, das 0,001 millimolares Tetrodotoxin enthält. Stellen Sie den Elektroporatorimpuls auf eine Amplitude von minus 5 Volt, einen Rechteckimpuls, einen Zug von 500 Millisekunden, eine Frequenz von 50 Hertz und eine Impulsbreite von 500 Mikrosekunden ein. Füllen Sie eine Glaspipette mit 5 Mikrolitern plasmidhaltiger interner Lösung und schnippen und klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf die Spitze, um eingeschlossene Blasen zu entfernen.
Verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um zu bestätigen, dass die Spitze nicht beschädigt ist, und befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode. Wenn die Spitze mit dem aCSF in Berührung kommt, notieren Sie die Pipettenwiderstandsanzeige des Elektroporators. Um eine Schnittkultur zu isolieren, schneiden Sie die Membran des Kultureinsatzes mit einer scharfen Klinge ab und übertragen Sie die Schnittkultur vorsichtig mit einer spitzwinkligen Pinzette in die Elektroporationskammer. Fixieren Sie dann die Kulturposition mit einem Slice-Anker.
Für die Elektroporation der interessierenden Zellen üben Sie mit dem Mund Überdruck auf die Pipette aus und manövrieren Sie die Pipettenspitze mit den dreidimensionalen Drehreglern in die Nähe der Oberfläche der Schnittkultur. Betrachten Sie die Kultur mit dem Mikroskop, nähern Sie sich der Zielzelle mit der Spitze und halten Sie den Überdruck aufrecht, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet. Bei der Visualisierung des Grübchens wird schnell ein leichter Unterdruck mit dem Mund ausgeübt, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Dichtung bildet.
Die Membran dringt leicht in die Pipette ein. Es sollte eine etwa 2,5-fache Erhöhung des Anfangswiderstands der Pipette beobachtet werden, was sich in einer Tonerhöhung aus den Lautsprechern zeigt. Üben Sie schnell wieder positiven Druck aus, damit sich das Grübchen neu bildet. Führen Sie dann sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen durch, wie gerade gezeigt, ohne Pause. Halten Sie nach dem letzten Druckimpuls den Unterdruck für 1 Sekunde aufrecht. Der Ton aus den Lautsprechern erreicht einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe. Verwenden Sie das Fußpedal, um den Elektroporator schnell zu pulsieren.
Ziehen Sie die Pipette nach der Elektroporation vorsichtig etwa 100 Mikrometer von der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben, und üben Sie erneut Überdruck aus, um sicherzustellen, dass der Widerstand ähnlich der Ausgangsanzeige ist, bevor Sie sich der nächsten Zelle nähern. Wenn alle gewünschten Zellen elektroporiert wurden, überführen Sie die Schnittkultur in einen der vorbereiteten Frischkultureinsätze und platzieren Sie den Einsatz bis zu 3 Tage lang bei 35 Grad Celsius.