Isolierung von zirkumvallaten Papillen (CVP) Epithel aus Mausmodell: Ein enzymatisches Verfahren zur Trennung von CVP-Epithel aus der Mauszunge

Die dorsale Oberfläche der Mauszunge ist mit drei Hauptarten von erhabenen Vorsprüngen bedeckt, die Papillen genannt werden, nämlich pilzförmige, zirkumvallate und fadenförmige Papillen. Die zirkumvallaten Papillen (CVP), die aus epithelialen Gräben bestehen, in denen sich die Geschmacksknospen befinden, werden von einer Bindegewebsschicht gestützt - der Lamina propria.

Um das ZVP-Epithel zu isolieren, beginnen Sie mit einer euthanasierten Maus in Rückenlage. Als nächstes schneiden Sie die Wangen ein und präparieren das dicke Gewebeband - das Zungenbändchen - um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen. Die herausgeschnittene Zunge in eine Schüssel mit gekühltem Puffer geben.

Schneide dann den vorderen Teil der Zunge aus. Injizieren Sie vorsichtig einen Verdauungscocktail mit Dispase- und Kollagenase-Enzymen in den subepithelialen Raum der ZVP-Region, zwischen dem Epithel und dem darunter liegenden Gewebe. Ziehen Sie die Nadel zurück, während Sie die Suspension in den Bereich injizieren.

Inkubieren Sie die Zunge für die entsprechende Dauer. Dispasen und Kollagenasen verdauen die extrazellulären Matrixproteine im Bindegewebe und erleichtern so die Trennung des ZVP-Epithels vom Gewebe. Nach der Inkubation werden Schnitte im Epithel in der ZVP-Region vorgenommen.

Trennen Sie das gelöste Epithel vorsichtig vom darunterliegenden Gewebe. Übertragen Sie schließlich das abgetrennte ZVP-Epithel in ein proteinbeschichtetes Röhrchen, um zu verhindern, dass Gewebe an der Röhrchenwand kleben bleibt. Das CVP-Epithel kann für die Weiterverarbeitung gelagert werden.

Nachdem Sie eine erwachsene Maus eingeschläfert haben, verwenden Sie eine große sterile Präparierschere, um die Wangen zu schneiden und den Kiefer zu brechen. Heben Sie dann die Zunge an und schneiden Sie das Zungenbändchen, um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen. Schneide die Zunge heraus und sammle sie in sterilem, eiskaltem dPBS mit Calcium und Magnesium.

Entfernen und verwerfen Sie unter einem Präpariermikroskop die vordere Zunge, indem Sie mit einer Rasierklinge nur den vorderen Teil der intermolaren Eminenz abschneiden. Entfernen Sie dann mit einem feinen Tuch alle Haare und überschüssige Flüssigkeit von der hinteren Zunge.

Füllen Sie als nächstes eine 1-Milliliter-Spritze mit 200 bis 300 Mikrolitern Injektionsenzymlösung und führen Sie eine 30-Gauge-Nadel mit einem Durchmesser von 1/2 Zoll knapp über der intermolaren Eminenz bis zum Inneren der zirkumvallaten Papillen oder ZVP ein. Injizieren Sie die Enzymlösung unter und an den seitlichen Rändern des ZVP zwischen dem Epithel und dem darunter liegenden Gewebe. Ziehen Sie die Spritze langsam und kontinuierlich von der Zunge zurück, während die Lösung injiziert wird.

Inkubieren Sie die Zunge in sterilem calcium-/magnesiumfreiem dPBS bei Raumtemperatur für genau 33 Minuten. Machen Sie mit einer extra feinen Präparierschere kleine Schnitte im Epithel beidseitig und knapp vor dem ZVP. Schälen Sie dann das Epithel vorsichtig, indem Sie es mit einer feinen Pinzette anheben. Sobald das Grabenepithel vom darunter liegenden Bindegewebe befreit ist, legen Sie es in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit FBS vorbeschichtet ist.