Injektion von Mikrobläschen in isolierte Mausembryonen: Eine Technik zur Verabreichung von Mikrobläschen-Kontrastmitteln in das Gefäßsystem lebender Mausembryonen

Für die Verabreichung von Mikrobläschen beginnen Sie mit einer gleichmäßigen Suspension von Endothelzell-zielgerichteten, lipidschalenförmigen Mikrobläschen, die einen gasförmigen Kern in einer Spritze umfassen, die mit dem Schlauch verbunden ist.

Laden Sie diese Baugruppe in eine Spritzenpumpe und befestigen Sie eine Glasnadel am Schlauch. Übertragen Sie nun einen gekühlten Mausembryo, der bestimmte Endothelzellrezeptoren exprimiert, in eine Schale, die auf dem Tisch eines Stereoskops platziert ist.

Befreien Sie den Embryo vorsichtig aus dem Dottersack und der Amnionmembran. Den Sack und die Plazentaränder sichern. Spülen Sie den Embryo mit einem warmen Puffer ab, um seine Durchblutung wiederherzustellen. Decken Sie den Embryo mit vorgewärmtem Ultraschallgel ab, um eine optimale Übertragung der Ultraschallwellen zu gewährleisten. Ergänzung mit Puffer, um seine physiologischen Bedingungen aufrechtzuerhalten.

Injizieren Sie die Mikroblasensuspension vorsichtig mit der gewünschten Flussrate in eine geeignete Vene auf der fetalen Membranoberfläche der Plazentabandscheibe, indem Sie die Spritzenpumpe verwenden. Die injizierten Mikrobläschen wandern durch den Kreislauf und binden an die spezifischen Rezeptoren auf den Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden.

Verwenden Sie einen Ultraschallwandler, um hochfrequente Ultraschallwellen an den Embryo zu übertragen. Die hochkompressiblen Gaskerne der Mikrobläschen bewirken, dass sie nichtlinear schwingen und Ultraschallwellen mit Frequenzen streuen, die sich von den einfallenden Wellen unterscheiden. Diese Signale und die linearen Signale des Gewebes kehren zum Schallkopf zurück.

Der Schallkopf leitet sie an ein bildgebendes System weiter, das die Streusignale der Mikrobläschen von den Gewebesignalen unterscheidet und so kontrastverstärkte Ultraschallbilder der embryonalen Blutgefäße erzeugt.

Pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Mikrobläschen-Stammlösung und fügen Sie es dem Aliquot der Kochsalzlösung hinzu. Mischen Sie durch leichtes Rühren mit der Spitze der Pipette. Verwenden Sie dann eine 21-Gauge-Nadel, um die verdünnte Mikroblasenlösung in eine saubere Spritze zu ziehen. Entfernen Sie nach dem Entfernen der Nadel alle Luftblasen von der Spritze und befestigen Sie den Luer und den Schlauch. Schieben Sie die Lösung langsam bis zum Ende des Schlauchs und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.

Führen Sie abschließend die Spritze in ein Spritzeninfusionspumpenset ein, um die Mikrobläschen mit einer Geschwindigkeit von 20 Mikrolitern pro Minute für ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern abzugeben. Befestigen Sie eine gezogene Glasnadel am Ende des Schlauchs. Bewegen Sie die Pumpe in die Nähe der Einspritzstufe. Verwenden Sie einen perforierten Löffel, um einen Embryo nach dem Zufallsprinzip auszuwählen und aus der Schale des gekühlten Mediums zu entfernen. Legen Sie den Embryo in eine Sezierschale, die sich auf dem Ultraschalltisch unter dem Stereoskop befindet.

Lokalisieren Sie als Nächstes die Seite des Embryos, die am wenigsten vaskularisiert erscheint. Hier ist ein Bereich mit geringer Vaskularisation, der im Allgemeinen an die Kopfregion angrenzt. Schneiden oder reißen Sie dann mit einer feinen Pinzette gerade so viel vom Dottersack und den Fruchtwasserhäuten ab, dass der Embryo von innen heraus entnommen werden kann, aber nicht mehr. Als nächstes manövrieren Sie den Sack vorsichtig um den Embryo herum. Positionieren Sie dann den Embryo auf die Seite, mit der Plazenta und den Nabelgefäßen vorne.

Stabilisieren Sie die Sezierschale mit kleinen Knetstücken. Stecke den Dottersack und die Ränder der Plazenta mit vier Insektennadeln fest und vermeide dabei größere Gefäße. Waschen Sie den Embryo mit einer Spritze mit vorgewärmtem PBS bei 45 Grad Celsius, bis zu sehen ist, dass Blut in den Embryo fließt. Die Nabelarterie ist an dem pulsierenden, leuchtend roten Blut zu erkennen. Die Nabelvene und das zugehörige Gefäßnetz haben dunkleres Blut und überlagern in der Regel das Blut der Nabelschnurarterie auf der Plazentaseite.

Positionieren Sie die Schale an dieser Stelle so, dass die Injektion bequem durchgeführt werden kann. Sobald der Embryo wiederbelebt ist, bedecken Sie ihn, aber nicht die Plazenta, mit vorgewärmtem Ultraschallgel. Entferne mit einer feinen Pinzette vorsichtig alle Luftblasen um den Embryo herum und fülle die Schale mit vorgewärmtem PBS auf. Behalten Sie während des gesamten Eingriffs den Lösungsstand in den PBS- und Gelspritzen im Auge und geben Sie bei Bedarf Ersatzspritzen in das Heizbecherglas.

Montieren Sie als nächstes die Glasnadel auf eine große Knetkugel am Rand der Sezierschale und führen Sie das Nadelende in die PBS ein. Wählen Sie eine Vene auf der Chorionoberfläche der Plazentascheibe, die so weit vom Hauptast entfernt ist, wie es sinnvoll ist. Schneide dann die Nadelspitze mit einer Schere an die Gefäßgröße ab und schneide die Spitze in einem leichten Winkel ab. Verwenden Sie die Kante der Federschere, um gezackte Kanten des Glases zu entfernen.

Injizieren Sie nun mit der Spritzenpumpe die Mikroblasenlösung langsam mit 20 Mikrolitern pro Minute in die Glasnadel, bis die gesamte Luft aus der Nadelspitze ausgestoßen wird und die Mikrobläschen frei in das PBS fließen. Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie sie auf ein Injektionsvolumen von 20 Mikrolitern ein. Lassen Sie keine Luft in die Injektionsnadel eindringen, um zu vermeiden, dass Luft in das Gefäßsystem des Embryos injiziert wird.

Führen Sie die Glasnadelspitze vorsichtig in die ausgewählte Vene in der Plazenta ein und stellen Sie sicher, dass sie unbeweglich ist. Schwenken Sie den Stereoskopkopf weg und positionieren Sie den Ultraschallwandler so, dass der Embryo gleichmäßig zwischen den Herden bei 6 und 10 Millimetern liegt. Starten Sie als Nächstes die Bildgebung und beginnen Sie mit der Bolusinjektion der Mikrobläschen. Nach einer Minute, wenn die Injektion abgeschlossen ist, starten Sie den Timer für den Datenerfassungsschritt.