Tupferbasierte Isolierung von konjunktivalen kommensalen Bakterien: Eine Technik zur Isolierung kommensaler Bakterien aus der Bindehaut des Mausmodells

Die Bindehaut des Auges beherbergt kommensale Bakterien. Diese einheimische Mikroflora schützt das Auge vor Infektionen, indem sie die Immunzellen aktiviert, um schädliche Mikroben anzugreifen, die in die Augenschleimhaut gelangen.

Um kommensale Bakterien zu isolieren, platzieren Sie eine anästhesierte Maus in einer seitlichen Position. Nehmen Sie einen sterilen Augenabstrich, der in ein geeignetes Medium getaucht ist. Führen Sie die feuchte Tupferspitze in die mediale Bindehautregion des linken Auges ein. Drücken Sie den Augapfel und bewegen Sie den Tupfer entlang der Bindehaut hin und her, um eine vielfältige kommensale Population zu erfassen.

Entfernen Sie den Tupfer und rühren Sie ihn in ein Röhrchen mit mikrobiellem Anreicherungsmedium. Dieser Schritt gibt die eingeschlossenen Bakterien aus dem Wattenetz des Tupfers an das Medium ab. Entsorgen Sie den Tupfer und inkubieren Sie das Röhrchen, um den Beginn des Bakterienwachstums zu erleichtern.

Geben Sie einige Tropfen des mit dem Augentupfer beimpften angereicherten Mediums im gewünschten Muster auf eine Blutagarplatte und inkubieren Sie. Das in den Medien enthaltene Kasein und Sojapeptone liefern den für die Peptidsynthese erforderlichen Stickstoff, während das Natriumchlorid das osmotische Gleichgewicht aufrechterhält.

Kommensale Bakterien besitzen Hämolysin-Enzyme, die das im Blut vorhandene Hämoglobin verdauen. Dadurch entsteht ein charakteristisches Muster auf der Agarplatte, wodurch sich verschiedene Bakterien zu morphologisch unterschiedlichen Kolonien vermehren. Zählen Sie die Anzahl der Völker, um ihre relative Häufigkeit in der Bindehaut zu bestimmen.

Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig betäubt ist, indem Sie ein Hinterfußpolster zusammendrücken. Fahren Sie nur fort, wenn keine Bewegung vorhanden ist. Weisen Sie eine Hand dem Umgang mit anästhesierten Mäusen und der anderen Hand dem Augenabstrich und der Kultur zu. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig und legen Sie sie mit dem linken Auge auf die Seite auf die Arbeitsfläche. Besprühen Sie behandschuhte Hände mit Isopropanol und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch ab.

Lösen Sie den Deckel eines beschrifteten BHI-Mikrozentrifugenröhrchens mit der speziellen Hand für die Medienhandhabung und setzen Sie das Röhrchen wieder in das Gestell ein. Tauchen Sie die mit Watte überzogene Spitze des Augentupfers in das BHI. Ziehen Sie dann den Tupfer aus dem Röhrchen, während Sie die Spitze zweimal gegen den Schlauch schwenken, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und zu entfernen.

Halten Sie die Maus mit der Maus vorsichtig am Nacken. Legen Sie mit der anderen Hand die Spitze des Augentupfers gegen die mediale Bindehautregion des linken Auges. Drücke den Augapfel leicht auf und bewege den Tupfer in einer Fensterputzbewegung 10 Mal zwischen Unterlid und Auge, wobei du einen konstanten Druck aufrechterhältst. Ohne das Fell zu berühren, entfernen Sie vorsichtig die Spitze des Tupfers senkrecht zur Stelle, an der er eingeführt wurde. Legen Sie den Tupfer mit der Watteseite nach unten direkt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen mit BHI-Medium.

Tragen Sie einen Augentropfen auf das abgetupfte Auge auf. Falls gewünscht, besorgen Sie sich Haut- oder Felltupfer für Kontrollproben und sterilisieren Sie die Handschuhe zwischen jedem Tupfer entsprechend. Wenn Sie fertig sind, setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein. Lassen Sie den Tupfer 10 bis 15 Minuten auf Eis stehen. Sterilisieren Sie dann die behandschuhten Hände und entfernen Sie den Tupfer, während Sie die Spitze 10 Umdrehungen lang mit dem Medium mischen. Ziehen Sie den Tupfer heraus, indem Sie die Spitze fünf Umdrehungen lang gegen die Innenwand des Röhrchens wirbeln, und entsorgen Sie ihn in einem Behälter für biologische Gefahren. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus.

Reichern Sie die Probe an, indem Sie die Röhrchen 1 Stunde lang statisch bei 37 Grad Celsius inkubieren. Beschriften Sie während der Inkubation eine TSA-Platte mit Raumtemperatur pro Mausaugenabstrich oder Kontrolltupfer und teilen Sie sie in zwei Hälften. Nehmen Sie die angereicherten Proben aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Die Proben kurz vortexen, um sie zu mischen. Aliquotieren Sie dann 10 Mikroliter der Probe auf die TSA-Platte und kippen Sie die Platte, um einen Streifen zu bilden. Wiederholen Sie dies zweimal.

Auf der anderen Seite der Trennlinie der Platte erstellst du 10 Punkte mit je 10 Mikrolitern Probe. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden, 2 Tage und 4 Tage in einer sauberen Kammer, die ein Austrocknen der Agarplatten verhindert. Zählen Sie die Völker in den Streifen. Notieren Sie die Morphologie und berechnen Sie koloniebildende Einheiten pro Tupfer für morphologisch ähnliche Isolate.