Warum ist die longitudinale Bildgebung für die Zielvalidierung bei Stoffwechselerkrankungen wichtig?

Die longitudinale Bildgebung ermöglicht die wiederholte Beobachtung zellulärer Dynamiken im selben Tier über die Zeit, wodurch Forscher die Dauerhaftigkeit und Konsistenz zielvermittelter Effekte auf die Betazellfunktion und die Inselarchitektur beurteilen können, was fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen in Zielvalidierungsprogrammen unterstützt.

Wie verbessert die Isolierung von Pankreasinseln aus der Darmbewegung die Datenqualität?

Das metallplattenunterstützte Abbildungsfenster trennt die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm, wodurch Bewegungsartefakte durch Peristaltik reduziert werden und eine stabile, hochauflösende Abbildung zellulärer Strukturen ermöglicht wird, was für zuverlässige quantitative Messungen bei der Assay-Entwicklung unerlässlich ist.

Welche quantitativen Messungen ermöglichen die Beurteilung der Betazellfunktion in diesem Modell?

Die Methode ermöglicht die Messung der Migration von Beta-Zellen, des intrazellulären Kalziumflusses, der Inselgröße und der vaskulären Perfusion mittels Zeitrafferaufnahmen und Z-Stapel-Bildgebung und liefert funktionelle Messgrößen, die genetische oder pharmakologische Interventionen mit phänotypischen Ergebnissen in einem krankheitsrelevanten System verknüpfen.

Warum sind Replikationsanforderungen wichtig für die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Fachbereichen bei bildbasierten Assays?

Die Replikation stellt sicher, dass die Bildgebungsergebnisse über Tiere, Bediener und experimentelle Durchläufe hinweg konsistent sind, was entscheidend ist, um Vertrauen in die Assayausgaben aufzubauen und zuverlässige Vergleiche der Wirkstoffeffekte zwischen Entdeckungs-, translations- und präklinischen Teams zu ermöglichen.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind erforderlich, bevor die intravitale Bildgebung in eine Entdeckungspipeline integriert wird?

Die Implementierung erfordert die Fähigkeit zur quantitativen Bildanalyse, einschließlich der Verfolgung der Fluoreszenzintensität, der Objektsegmentierung und der Zeitreihenstatistik, um Bedingungen zu vergleichen und die Signifikanz beobachteter Veränderungen in der zellulären Dynamik oder Struktur zu bewerten.

Intravitale Bildgebung: Eine Methode zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse der Maus auf zellulärer Ebene durch ein stabilisiertes Bildgebungsfenster

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologie

0 Ansichten • 3:40 Min. • July 8th, 2025

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Bei der intravitalen Bildgebung werden die Zellen eines lebenden Tieres durch ein Bildgebungsfenster sichtbar, das in das Tier implantiert wird. Es ermöglicht die Langzeitbeobachtung der zellulären Dynamik, ohne deren Funktionen zu beeinträchtigen.

Nehmen Sie zunächst eine anästhesierte transgene Maus, der zuvor ein Pankreas-Bildgebungsfenster implantiert wurde, das auf einer Metallplatte ruht. Die Basisplatte trennt die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm und reduziert so Bewegungsartefakte aus physiologischen Bewegungen wie der Peristaltik.

Die transgene Maus exprimiert grün fluoreszierendes Protein oder GFP unter dem Insulin-Genpromotor, der in Betazellen von Inselzellen in der Bauchspeicheldrüse exprimiert wird.

Halten Sie anschließend den Mausschwanz fest und sprühen Sie Desinfektionsmittel, um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Führen Sie einen Katheter in die seitliche Schwanzvene ein. Injizieren Sie eine Lösung mit Antikörpern, die mit einer rot fluoreszierenden Sonde markiert sind, in die Schwanzvene. Diese Antikörper binden an die Zellen, die die Blutgefäße auskleiden, und färben sie rot.

Schalten Sie nun die Maus auf ein Intravitalmikroskopie-Setup. Setzen Sie das Pankreas-Bildgebungsfenster in den Fensterhalter ein. Starten Sie die Bildgebung bei geringer Vergrößerung, um grün fluoreszierende Inselcluster zu lokalisieren, die von rot fluoreszierenden Blutgefäßen umgeben sind. Erhöhen Sie die Vergrößerung, um eine qualitativ hochwertige Bildgebung einzelner Betazellen auf zellulärer Ebene zu erhalten.

Beginnen Sie mit dem Einschalten des Intravitalmikroskops, einschließlich der Laserleistung. Um einen Gefäßkatheter einzulegen, üben Sie mit dem Zeigefinger und dem dritten Finger Druck auf die proximale Seite des Schwanzes aus. Erhitzen Sie ggf. das Heck mit einer Lampe. Desinfizieren Sie die Schwanzvene mit einem 70%igen Ethanolspray, führen Sie dann einen 30-Gauge-Katheter in die laterale Schwanzvene ein und visualisieren Sie das Aufstoßen von Blut im PE-10-Röhrchen. Bringen Sie Seidenband auf den Katheter an, um ihn zu stabilisieren.

Injizieren Sie FITC-Dextran und TMR-Dextran oder andere Fluoreszenzsonden, je nach Bedarf, entsprechend der Kombination der Fluoreszenzsonden. Führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Körpertemperatur mit dem homöothermen Heizkissensystem automatisch zu regeln. Setzen Sie dann das Pankreas-Bildgebungsfenster, das während der Einrichtung der Intravitalmikroskopie vorbereitet wurde, in den Fensterhalter ein. Übertragen Sie die Maus von der chirurgischen Plattform in die Bildgebungsphase.

Um eine intravitale Bildgebung durchzuführen, beginnen Sie mit der Bildgebung der Bauchspeicheldrüse bei geringer Vergrößerung, z. B. vierfach, um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreas-Bildgebungsfenster zu scannen. Sobald der interessierende Bereich bestimmt wurde, wechseln Sie zu einer Objektivlinse mit höherer Vergrößerung, z. B. 20-fach oder 40-fach, um eine Bildgebung auf zellulärer Ebene mit einer lateralen und axialen Auflösung von etwa 0,5 Mikrometern bzw. 3 Mikrometern durchzuführen.

Führen Sie Z-Stack- oder Zeitraffer-Bildgebung durch, um die 3D-Struktur oder die Dynamik auf zellulärer Ebene, wie z. B. die Zellmigration, zu beobachten.