Antegrade Perfusionsmodell: Eine ex vivo Technik zur Perfusion isolierter Mausherzen

Beginnen Sie damit, eine betäubte Maus in Rückenlage zu bringen. Präpariere die Brusthöhle, um das Herz sichtbar zu machen. Verwenden Sie eine Pipette mit einer Spitze mit breiter Bohrung, um Saugdruck auszuüben und das Herz vom Körper der Maus in die Spitze zu saugen. Schneiden Sie das Herz an der Aorta heraus, um es aus dem Körper der Maus zu gewinnen.

Tauchen Sie das isolierte Herz in ein Becherglas, das einen nährstoffreichen Puffer enthält, der mit einem Antikoagulans ergänzt wird. Das Antikoagulans im Puffer bildet einen Komplex mit Kalzium, das in den Kardiomyozyten - den Herzmuskelzellen - vorhanden ist, wodurch die Kontraktion der Herzmuskulatur gestoppt und die Blutgerinnung verhindert wird.

Legen Sie dann die Herzspitze mit der Spitze nach unten auf einen Herzständer, der in einer Petrischale mit geeignetem Puffer aufbewahrt wird. Klemmen Sie die Aorta über den Vorhöfen und übertragen Sie das geklemmte Herz auf eine Perfusionsplatte.

Anschließend

wird eine Spritze-Nadel-Einheit entnommen, die einen geeigneten Perfusionspuffer enthält. Führen Sie die Nadel in den linken Ventrikel ein und stechen Sie in die Ventrikelkammer.

Wenn die Aorta eingeklemmt ist, setzt die intraventrikuläre Injektion die Aortenklappen unter Druck, sich zu öffnen. Folglich spült der Puffer das Blut antegrad durch die Herzkranzgefäße und durchblutet die Herzmuskulatur vollständig. Schließlich fließt der Puffer durch die Lungenvenen. Dies bietet ein erfolgreich durchblutetes Herz für nachgelagerte Anwendungen.

Öffnen Sie bei der Entnahme von Mäuseherzen nach Bestätigung der Euthanasie und Rasur des Bauches schnell die Brusthöhle, um das Herz freizulegen, und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, deren Spitze ungefähr auf die Größe des Herzens geschnitten ist, um das Herz in die Pipette zu saugen. Heben Sie die Pipette an, um genügend Platz für das Einführen einer gebogenen Schere zu schaffen, und verwenden Sie die Schere, um das Herz von der dorsalen Seite zu entfernen, wobei Sie darauf achten, dass die Vorhöfe nicht beschädigt werden.

Sofort das Herz für ca. 1 Minute in ein 30-Milliliter-Becherglas mit eiskaltem CIB EGTA geben. Wenn die Wehen aufgehört haben, legen Sie das Herz in eine 35-Milliliter-Kulturschale mit eiskaltem CIB EGTA und entfernen Sie die Lunge und anderes sichtbares Gewebe.

Legen Sie das grob gereinigte Herz mit der Spitze nach unten auf ein mit gekühltem CIB EGTA gefülltes Herzstativ und stellen Sie das Stativ unter ein stereoskopisches Mikroskop. Entfernen Sie das Fett und das Bindegewebe um die Aorta. Wenn die Länge der durchtrennten Aorta zu lang ist, schneiden Sie die Aorta direkt unter der Arteria brachiocephalica ab und richten Sie das Herz so aus, dass die vordere Fläche nach vorne zeigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Ende der Aorta anzuheben, und verwenden Sie eine kleine Gefäßklemme, um die Aorta in der Nähe der Vorhöfe zu klemmen, während Sie sanft auf die Vorhöfe drücken.

Legen Sie dann das geklemmte Herz mit der vorderen Seite nach oben auf eine Perfusionsplatte und hydratisieren Sie das Herz mit einigen Tropfen CIB EGTA. Für die antegrade Perfusion laden Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit vorgewärmtem CIB EGTA, die mit einem flexiblen Verlängerungsschlauch und einer markierten Injektionsnadel verbunden ist, auf die Infusionspumpe und starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Wenn die Nadel und die Pumpe gefüllt sind, platzieren Sie die Injektionsnadel auf der Perfusionsplatte, mit der kürzeren Seite der diagonalen Form nach vorne, und schieben Sie die Nadel, bis sie gerade die Spitze des Herzens berührt.

Führen Sie die Nadel vorsichtig in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels in die Ventrikelkammer ein, ohne die Nadel zu verdrehen oder von der Platte zu lösen, und beobachten Sie die Markierung, um die Tiefe des Nadeleinstichs abzuschätzen. Wenn das Einstechen der Nadel abgeschlossen ist, sollte Blut aus der Koronararterie zu fließen beginnen.

Befestigen Sie die Injektionsnadel mit Klebeband an der Platte und erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 1 Milliliter pro Minute. Wenn das Herz erfolgreich durchblutet wird, sollte der Fluss des Puffers in der Kapillare direkt unter dem Epikard sichtbar sein.