Druckfixierung einer isolierten Maus-Pulmonalklappe: ein Verfahren zur Isolierung und chemischen Fixierung der Maus-Pulmonalklappe in geschlossener Konformation

Befestigen Sie zunächst eine eingeschläferte Maus in Rückenlage. Seitlich durch die Brustwand schneiden, um Zugang zur Brusthöhle zu erhalten und das Herz freizulegen. Schneiden Sie den rechten Vorhof heraus und injizieren Sie Kochsalzlösung in den linken Ventrikel, um das Blut aus dem Herzen abzulassen.

Durchtrenne die Gefäßverbindungen, indem du die großen Blutgefäße durchtrennst. Des Weiteren wird die Lungenarterie in einem geeigneten Abstand vom ventrikulo-arteriellen Übergang eingeschnitten, der als Kanal für die Druckbeaufschlagung dient. Entfernen Sie die Ventrikel, um die ventrikuläre Seite dem atmosphärischen Druck auszusetzen.

Befestigen Sie nun einen Druckbeaufschlagungsschlauch in der Lungenarterie und sorgen Sie für einen ausreichenden Abstand zwischen dem ventrikulo-arteriellen Übergang und dem Schlauchende, damit sich die Klappensegel während der Druckbeaufschlagung bewegen können.

Schließen Sie das mit Kochsalzlösung gefüllte Reservoir an den Schlauch an, das in einer berechneten Höhe relativ zur Pulmonalklappe befestigt ist, die auf dem gewünschten hydrostatischen Druck basiert, der auf die arterielle Seite der Klappe ausgeübt werden soll. Die unidirektionale Strömung von der arteriellen Seite mit dem angelegten hydrostatischen Druck führt zum Verschluss der Klappensegel und zur Dehnung des Pulmonalstamms.

Führen Sie anschließend ein geeignetes Fixiermittel in das Reservoir ein und setzen Sie die Perfusion fort. Das perfundierte Fixiermittel stabilisiert die zelluläre Morphologie und Gewebearchitektur.

Legen Sie eine mit Fixiermittel getränkte Gaze über das Gewebe, um das Gewebe um die Klappe herum zu fixieren und ein Austrocknen zu verhindern. Bewahren Sie die feste Herzklappe bis zur Verwendung in einem Fixiermittel auf.

Beginnen Sie mit dem Autoklavieren der Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden, einschließlich feiner Scheren, Mikrozangen, mikrovaskulärer Klemmen, Klemmzangen, Mikronadelhalter, Federscheren und Retraktoren.

Nachdem Sie eine erwachsene C57 Black 6-Maus eingeschläfert haben, legen Sie sie in einer dorsalen Liegeposition auf ein Tablett, sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband und führen Sie die Thorakotomie durch. Legen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen, entfernen Sie dann den rechten Vorhof und perfundieren Sie den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die untere Hohlvene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen und etwa 2 Millimeter oberhalb des ventrikulo-arteriellen Übergangs schneiden, der als Kanal für die Druckbeaufschlagung dient.

Entfernen Sie den linken und rechten Ventrikel, um die Kammern Atmosphärendruck auszusetzen, und stellen Sie sicher, dass die Struktur des Lungenstamms durch die Entfernung der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird. Anastomosen-Druckbeaufschlagungsschlauch mit der Lungenarterie, wobei ein Abstand von etwa 1 Millimeter zwischen dem sino-tubulären Übergang und dem Ende des Schlauchs verbleibt, um große Bewegungen der Segel und des Lungenstamms aufzunehmen.

Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck an und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind. Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie für einen ausreichenden Durchfluss durch den Schlauch, indem Sie den Abflusstrakt umschalten. Sobald der Durchfluss ausreichend ist, schalten Sie den Ausfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und sorgen Sie für eine Druckbeaufschlagung des Lungenstamms, die durch die Dehnung des Rumpfes gekennzeichnet ist.

Nach Bestätigung der Druckbeaufschlagung des Lungenstamms nach und nach die primäre Fixierlösung einarbeiten, bis 25% des Reservoirvolumens der Kochsalzlösung gespült sind. Legen Sie eine mit Fixiermittel getränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern. Perfundieren Sie das Fixiermittel 3 Stunden lang und füllen Sie das Reservoir wieder auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten.

Lagern Sie die Herzklappe nach der Perfusion bis zur Verwendung bis zu 1 Woche in der Fixierlösung bei 4 Grad Celsius.