Name: Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Lernen Sie die in utero Elektroporation zur gezielten Gentransfektion im embryonalen Mäusegehirn. Diese Methode ermöglicht präzise Transfektionen in kortikale Schichten und tiefe Hirnstrukturen wie Thalamus und Hypothalamus.

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Diese Arbeit wurde vom RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (verliehen TS) und RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, verliehen an MK) RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program gefördert (HFSP) (verliehen TS) und RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, verliehen an MK) gefördert dieser Arbeit.

1. Vorbereitung der Kapillar-und DNA-Lösung zur Injektion <ol><li> Purify Plasmid-DNA mit einem Maxi-Prep oder gleichwertiges Verfahren, um zu einer endgültigen Konzentration von 2-3 ug / ul. Aliquot 100 ug DNA, fügen Sie 10 &amp;mgr; l der schnellen grünen Farbstoff (1% Aktien) und TE (10 mM Tris Base, 1mM EDTA-Lösung, pH 8,0) und stellen ein Volumen von 100 ul die endgültige DNA-Konzentration zur Injektion Mix 1 g / machen ul. Die Konzentration von Plasmid-DNA verändert werden kann, hängt von der Größe des Plasmids, und auch ihre Transfektionseffizienz, die einzeln geprüft werden muss. </li><li> Drehen Sie die DNA-Lösung für 5 Minuten bei 14.000 RPM bei Raumtemperatur und sammeln Überstand, um alle Rückstände zu entfernen. </li><li> Ziehen Sie eine Glaskapillare tubea Glaskapillaren mit einer Mikropipette Abzieher. Pinch off der Spitze mit einer Pinzette, um die Spitze hat einen Durchmesser von 20-30 um. Messen Sie 800 um-1 mm von der Spitze und überprüfen Sie die Außendurchmesser von weniger als 60 pm (Abb. 1A). </li><li> Schließen Sie die Kapillare zu den Mikromanipulator, und füllen Sie mit Mineralöl. Um die Kapillare mit der DNA-Lösung, tauchen die Spitze in die Lösung zu füllen und zu saugen bis die DNA-Lösung. </li></ol> 2. Stick-Platin-Elektroden Hier haben wir Stick Platinelektroden (Nepe Gen, CUY611P2-1) in oberflächennahen Bereich des Gehirns, wie der Cortex (Abb. 1F) elektroporieren. 3. Vorbereitung von Mikroelektroden Verwenden Sie Mikro-Elektroden in tiefen Teilen des Gehirns (dh, Thalamus und Hypothalamus) (Abb. 2B-E) elektroporiert. <ol><li> Ein Ende des Wolfram (für negative Elektroden) und Platin (für positive Elektroden) Drähte auf vergoldeten gewickelt und fixiert mit Parafilm. Führen Sie den Draht um den Stamm ein Wattestäbchen und wickeln Sie beide Enden mit Parafilm (Abb. 1B). </li><li> Gleichmäßig schärfen die Spitze des Drahtes mit Sandpapier, bis sie 20-30 um Außendurchmesser und 60 pm von 800 um-1 mm von der Spitze (Abb. 1C und D) erreicht. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht Nagellack auf den Draht für die Isolierung. Nach der Nagellack getrocknet ist, verwenden Sie ein Aceton getränkten Wattestäbchen, um es von der Spitze (etwa 200 um von der Spitze) zu entfernen. Wichtiger Hinweis: Um Schäden an der Maus die Gebärmutter zu verhindern, ist der Anteil innerhalb von 800 um-1 mm von der Spitze sollte nicht mehr als 70 um im Durchmesser (Abb. 1E) werden. </li></ol> 4. Vorbereitung der Operation <ol><li> Anesthetize eine schwangere Maus (E9.5-E15.5). Wir zeigen, Betäubung mit pharmazeutischer Qualität Natrium-Pentobarbital (Tabelle II; 50 ug pro Gramm Körpergewicht, intraperitoneal injiziert, und warten Sie 5 min). Alternativen zum Natrium-Pentobarbital als Narkosemittel beinhalten Ketamin / Xylazin Injektion oder Gas Anästhetika (Gas ist bevorzugt kurzer Dauer Verfahren). Die Injektion mit Aufmerksamkeit sollte getan werden, um alle Organe zu vermeiden, sonst wird es dazu führen, dass die Gebärmutter schädigen oder töten Tier. Als erfolgreiche IP geschehen ist, ist die Überlebensrate mehr als 95%. Auch die Chirurgie kann in Open-Air-Umgebung durchgeführt werden. Bevor begann die Operation, Test für eine fehlende Reaktion durch das Tier zu kneifen ihre Fußspitze Betäubung bestätigen. </li><li> Shave das Haar aus dem Bauch mit einer Rasierklinge und 50% EtOH. Bereiten Sie die Haut mit wechselnden scrubs von betadine und Alkohol (70%). </li><li> Machen Sie einen Schnitt am Bauch-Mittellinie mit einer feinen Schere und ziehen Sie alle Uterushörner vorsichtig auf 37 ° C vorgewärmten Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)-angefeuchtet Baumwollgaze, die um die Wunde gelegt wird. Halten Sie die Gebärmutter feucht mit PBS die ganze Zeit. </li><li> Halten Sie eine flexible Glasfaser-Kabel zwischen dem Zeige-und Mittelfinger und legen Sie es unter dem Uterushorn. Saubere Kabel mit 70% EtOH vor dem Gebrauch. Kein Mikroskop oder Lupe ist für die Visualisierung benötigt. Position Gebärmutter zwischen den Glasfaser-Licht-Optik-Kabel und den Daumen, und drücken Sie sanft nach oben zu drücken den Embryo näher an der Gebärmutterwand. </li></ol> 5. Die Injektion von DNA und Elektroporation <ol><li> Als Embryo positioniert ist, legen Glas sorgfältig Kapillare in Ziel Herzkammer und spritzen ca. 1 ul DNA-Lösung (Abb. 2A). </li><li> Für die Elektroporation auf oberflächliche Teil des brainIf Verwendung mit Stick Platin-Elektroden für electoporation, legen Sie die Elektroden außerhalb der Gebärmutter und gelten vorgeschlagen Rechtecksignale Stromimpulse nach Herstellung der Anweisung (Tabelle I). Wenn usingFor Elektroporation zu tieferen Teil des Gehirns, nmicro Elektroporation werden eedle Typ Elektroden verwendet. Iinsert einem feinen Wolfram negative Elektrode in die DNA injiziert Ventrikel und einer Platin-Elektrode in die Gebärmutter und Ort Zielregion zwischen zwei Elektroden, dann schlug Rechtecksignale Stromimpulse (Tabelle I) (Abb. 2B) gelten. </li></ol> 6. Beitrag Elektroporation <ol><li> Legen Sie die Uterushorn zurück in seine original Lage mit und fügen Sie 500 ul von 37 ° C vorgewärmten PBS. </li><li> Suture die innere Schicht mit chirurgischem Nahtmaterial und schließen äußere Schicht mit einem 9 mm autoclipauto Clip. </li><li> Legen Sie Tiere auf einem Heizkissen für 2 Stunden, damit aus der Narkose. Analgetika wie Carprofen oder Buprenorphin kann für postoperative Schmerzen verabreicht werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Einige Beispiele der kortikalen Elektroporation von pCAG-EYFP konstruieren mit Stick Platinelektroden zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Abbildung Abbildung 32 dargestellt. Brains sind E13.5, E14.5 und E15.5 elektroporiert und geerntet postnatalen Tag (P) 6. ADie ntibody Färbung RORC zeigt Lage der Schicht 4 und die Position der EYFP transfizierten Zellen durch GFP Antikörper-Färbung werden aufgedeckt, und die beiden Bilder sind super verhängt (Abb. 3A und B). Labeled kortikalen Zellen Schicht der kortikalen Zellen elektroporiert unterscheidet sich deutlich in jedem Experiment (Abb. 32), die zeitabhängige Elektroporation macht Corticalis-spezifische GOF / LOF möglich suggeriert. Die Lebensfähigkeit von Embryonen und die Effizienz der Transfektion von Zellen variiert nach Alter des Embryos und die Lage der Elektroporation abhängig. Die Proben in Tabelle 1 aufgelistet sind, jedoch sollten die Bedingungen für jede Elektroporation je auf der Bühne und ein Teil des Gehirns optimiert werden. Elektroporation in eine tiefe Gewebe wie Thalamus und Hypothalamus mit der Verwendung von Platin-Elektroden-Stick geben oft geringe Effizienz (Tabelle 1). Dieses Problem kann durch Verwendung von Mikro-Elektroden whichelectrodes, die tiefen Teile des Gehirns erreichen wird gelöst werden. Abbildung 3 4 zeigt beispielsweise der pCAG-EYFP Elektroporation in den Entwicklungsländern Zwischenhirn. Plasmid-DNA-Lösung wird in der 3. Ventrikel bei E11.5 injiziert, gefolgt von Mikro-Elektroporation (Abb. 3C4C). Die Elektroporation Bereich ist in den Thalamus beschränkt, wo die meisten Axone zum Kortex (Abb. 3B4B). Axon-Projektion der Schicht 4 des Kortex kann auch visualisiert EYFP, die bis fillesfills das gesamte Neuron. (Abb. 3A4A). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Cartoon schematische demonstriert die richtige Form der Kapillare. (A) A Glaskapillare gezogen wird mit einer Mikropipette puller bestimmte Form zu machen. Ein Tipp ist abgeschnürt durch Zangengeburt zu 20-30 um zu machen. Messen Sie 800 um-1mm von der Spitze (rote Klammer) und stellen Sie sicher, dass externe Durchmesser von weniger als 60 pm (grüne Klammer) ist. (B) Ein Ende des Wolfram-oder Platin-Drähte auf vergoldeten gewickelt und fixiert mit Parafilm. Dann nutzen Sie Schleifpapier, ihre Spitze stellen, um 20-30 um Außendurchmesser und 60 um 1 mm von der Spitze zu werden. (C) Bild von der Wolfram-Draht vor der Formgebung. (D) Bild von der Wolframdraht nach der Formgebung. (E) Bild von der Wolframdraht nach dem Auftragen dünn Nagellack. Maßstabsbalken in E ist 10 pm (kleinste Skala) für CE. (F) Stick Platinelektroden (Nepa Gen. CUY611P2-1). Balken in F ist 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Cartoon-Schema des chirurgischen Eingriffs. (A) Schematische Darstellung der Injektion in Seitenventrikel oder großen Embryonen (links) und in 3 rd Ventrikels oder kleine Embryonen (rechts). (B) Schematische Darstellung der electrporation durch Platin Stabelektrode (links) und Nadel Elektrode (rechts). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Entwickeln Maus Telencephalon wurde mit pCAG-EYFP bei E13.5 (A), E14.5 (B) und E15.5 (C) elektroporiert und geerntet P6. Die Gehirne wurden geschnitten koronalen und gefärbt mit GFP-Antikörper oder Antikörper RORC getrennt und Bilder zusammengeführt werden. (A) Elektroporation von pCAG-EYFP Plasmid bei E13.5 transfizieren vielen Schicht 4 Neuronen. die Überschneidung mit Schicht 4 Marker RORC. (B) Elektroporation von pCAG-EYFP Plasmid bei E14.5 Transfektion von Zellen, die mehr oberflächlich als Schicht 4 Neuronen. (C) E15.5 Elektroporation label viele oberflächliche Neuronen wie Layer 2 / 3. Maßstabsbalken 200 um. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Transfektion von EYFP in thalamo-kortikalen Axone (TCA). (A) TCA Endstation in kortikalen Schicht 4 wird durch GFP-Antikörper-Färbung zeigte. RORC Antikörper-Färbung wird verwendet, um eine Position der Schicht 4 zu enthüllen. Beide Bilder stammen aus demselben Abschnitt übernommen und zusammengeführt. (B) Position der Elektroporation in den Thalamus wird auch von GFP Antikörper-Färbung und RORC Färbung, die ihren Ausdruck in den Thalamus 11 begrenzt wird angezeigt. (C) Cartoon Schaltplan für thalamischen Elektroporation und TCA-Projektion gezeigt. Maßstabsbalken 200 um.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll haben wir nur beschrieben Vorteile der Technik der pCAG-EYFP Transfektion in den geschützten Bereich einer kleinen embryonalen Gehirn mit verschieden geformten Elektroden. Zum Vergleich der Transfektionseffizienz von anderen Promotor zuvor beschrieben wird, zeigt, welche Zelltypspezifität 1. Allerdings gibt es Einschränkungen für die Technik, wie zum Beispiel die Transfektion ist nur vorübergehend und variiert abhängig von der Plasmid, es muss nicht jede Zelle Spezifität und es ist schwer, die Zahl der transfizierten Zellen zu steuern. ThereforeHowever, wird die Kombination dieses Protokoll mit anderen Techniken weiter bieten Möglichkeiten für verschiedene Methoden zur Manipulation. Zunächst wird Einbeziehung zellspezifischen Promotors in Plasmid-DNA ermöglichen zelltypspezifisch Transfektion, wie Neuronen, Gliazellen und Astrozyten. Zweitens, da die Transfektion transient ist, ist es nicht geeignet für Wissenschaftler, die die Funktion des Gens im späteren Leben analysieren möchten. Daher wird die Kombination mit einer Transposase, um Plasmid-DNA in das Genom integrieren sie in eine stabile Transfektion 8 zu konvertieren. Als nächstes Annahme des Tet-On-oder Tet-Off-System wird es möglich, den Zeitpunkt oder Zelltyp-spezifische Gen-Expression in neuronalen Zellen 8 manipulieren. Alternativ kann man dieses Protokoll mit Tamoxifen-induzierbare Cre-ER (T) Rekombinasen 9 und Reporter-Mäuse 10 zu kombinieren. Diese breite Zugänglichkeit von Geweben wird sich drastisch verändern experimentellen Designs in den Neurowissenschaften eingesetzt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Bare Wolfram Drahtdurchmesser 125 pm </td><td> AM-Systeme </td><td> 797600 </td></tr><tr><td> blanken Platindraht Durchmesser 125 pm </td><td> AM-Systeme </td><td> 767000 </td></tr><tr><td> Stabelektroden </td><td> Nepa-Gen </td><td> CUY610P4-1 </td></tr><tr><td> Glaskapillare </td><td> Stölting </td><td> 50611 </td></tr><tr><td> Mikromanipulator </td><td> KD Scientific </td><td> KDS310 </td></tr><tr><td> Schere </td><td> Roboz </td><td> RS-5865 </td></tr><tr><td> Impulsgeber </td><td> AM-Systeme </td><td> Modell 2100 </td></tr><tr><td> 9 mm autoclip </td><td> Roboz </td><td> RS-9260 </td></tr><tr><td> mit vergoldeten </td><td> WPI </td><td> 5482 </td></tr><tr><td> RORC Antikörper </td><td> Perseus Proteomics </td><td> H3925 </td></tr></tbody></table>

maus in utero elektroporation: kontrollierte spatiotemporal gene transefection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Um zu verstehen, die Funktion von Genen in bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirns, einschließlich Signalmolekülen und Axon Führung Moleküle, lokale Gentransfer oder Knock-out ist erforderlich, zum Ausdruck gebracht. Gene targeting knock-in oder Knock-out in die lokalen Regionen möglich ist, mit Kombination mit einer bestimmten CRE Linie, die mühsam, kostspielig ist, und zeitaufwändig durchzuführen. Daher wird eine einfache Transfektion Methode, eine in utero Elektroporation Technik, die mit kurzen Zeit durchgeführt werden kann, sehr nützlich sein, um die mögliche Funktion der Kandidatengene vor der Erzeugung von transgenen Tieren 1,2 zu testen. Zusätzlich zu dieser, in utero Elektroporation Ziele Bereichen des Gehirns, wo keine besonderen CRE Linie existiert und wird begrenzt embryonalen Letalität 3,4. Hier präsentieren wir eine Methode, in utero Elektroporation Kombination von zwei verschiedenen Arten von Elektroden für die einfache und bequeme Gentransfer in Zielgebieten des sich entwickelnden Gehirns. Zunächst wird eine einmalige Beteiligung Methode von Embryonen mit Hilfe eines optischen Lichtleiter-Kabel machen kleine Embryonen (von E9.5) sichtbar für die gezielte DNA-Lösung Injektion in Ventrikel und Nadel-Typ Elektroden Einsetzen der gezielten Hirnareal 5,6. Die Strukturierung des Gehirns wie kortikalen Bereich auftreten in einem frühen embryonalen Stadium, daher sind diese frühen Elektroporation von E9.5 einen großen Beitrag zur gesamten Bereich Strukturierung Ereignis zu verstehen. Zweitens verhindert die genaue Form einer Kapillare uterine Schäden, indem sie Löcher durch Einsetzen der Kapillare. Darüber hinaus sind die genaue Form der Nadelelektroden mit Wolfram-und Platin-Draht geschaffen und geschärft mit Schleifpapier und isoliert mit Lack 7, eine Methode, die im Detail in diesem Protokoll beschrieben ist. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA in eingeschränkten Bereichen des Gehirns und ermöglicht es kleinen Embryonen elektroporiert werden. Dies wird dazu beitragen, ein neues Fenster öffnen für viele Wissenschaftler, die auf die Zelldifferenzierung, Zellwanderung, Axon Anleitung arbeiten in einem sehr frühen embryonalen Stadium. Darüber hinaus wird diese Technik den Wissenschaftlern ermöglichen, Plasmid-DNA in tiefen Teilen des sich entwickelnden Gehirns wie Thalamus und Hypothalamus, wo nicht viele regionsspezifische CRE Linien existieren für gain of function (GOF) oder Funktionsverlust (LOF) Analysen zu transfizieren.

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Um die Funktion von Genen zu verstehen, die in einer spezifischen Region des sich entwickelnden Gehirns exprimiert werden, einschließlich Signalmolekülen und Axonleitmolekülen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine effiziente Gen-Transfektion im zentralen Nervensystem embryonaler Mäuse zu einem gewünschten Entwicklungszeitpunkt und in einem bestimmten Bereich des Gehirns zu erzielen. Dies wird zunächst durch die Herstellung präziser Kapillaren und nadelförmiger Elektroden erreicht, um eine Schädigung des Uterus zu vermeiden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, eine einzigartige Methode zum Halten der Embryonen mithilfe eines Lichtleitkabels zu erlernen, um kleine Embryonen sichtbar zu machen und eine gezielte DNA-Injektion durchführen zu können.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Elektroporation mit stabförmigen Elektroden auf der Uterusoberfläche durchzuführen, um DNA in oberflächliche Bereiche des Gehirns einzubringen; der letzte Schritt des Verfahrens ist die Durchführung einer Elektroporation mit nadelförmigen Elektroden in tiefere Strukturen des Gehirns, wie beispielsweise den Thalamus und Hypothalamus. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine schichtspezifische Transfektion oder eine effiziente Transfektion im Thalamus zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der herkömmlichen In-utero-Elektroporation liegt in der besseren Sichtbarkeit und Kontrolle der Lage der Embryonen im Uterus.Wir verwenden ein kabelähnliches Glasfasersystem, das es ermöglicht, Embryonen ab E 9,5 zu visualisieren, und Nadeln mit Hypodermis, um Plasmid-DNA in tiefere Bereiche des Gehirns, wie Thalamus und Hypothalamus, einzubringen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Gehirnentwicklung zu beantworten, wie neuronale Differenzierung, Gehirnmusterung und neuronale Vernetzung. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es schwer ist, die Nadel und die Elektroden zu formen und die korrekte Positionierung zu erreichen.Die Gebärmutter und Embryonen Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um zu sehen, wie man präzise Nadelelektroden herstellt und wie man Embryonen zur Elektrofreisetzung positioniert. Da diese beiden Schritte für erfolgreiche Ergebnisse entscheidend sind. Zur Vorbereitung der Kapillaren verwenden Sie einen Mikropipettenzug gemäß den Herstelleranweisungen.Bei diesem Verfahren verwenden wir einkammerige Glas-Kapillarrohre mit einem Durchmesser von einem Millimeter. Die gezogenen Nadeln sollten unter dem Stereomikroskop gemessen eine Länge von 800 Mikrometern bis einem Millimeter aufweisen und einen Außendurchmesser von weniger als 60 Mikrometern haben; anschließend werden die Nadelspitzen mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von 20 bis 30 Mikrometern abgeknipst. Jede Nadel sollte mit einem Messmikrometer vermessen werden.Bereiten Sie als Nächstes Mikroelektroden durch Wickeln vor. Wickeln Sie ein Ende eines Wolframdrahts um einen vergoldeten Pin. Verwenden Sie Wolframdraht für negative Elektroden und Platindraht für positive Elektroden.Befestigen Sie den Draht mit Param. am Stift. Stecken Sie anschließend den Draht in den Kunststoffstiel eines Wattestäbchens und wickeln Sie beide Enden gleichmäßig mit Phim ab. Schleifen Sie die Spitze des Drahtes mit feinem Schleifpapier sorgfältig zu, bis sie an der Spitze 20 bis 30 Mikrometer und zwischen 800 Mikometern und einem Millimeter von der Spitze entfernt 60 Mikrometer beträgt. Überprüfen Sie die endgültigen Abmessungen erneut mit einem Messmikrometer.Als Nächstes tauchen Sie den geschärften Draht in einen Tropfen Nagellack, um eine dünne Schicht auf dem gesamten Draht zur Isolierung aufzutragen. Nachdem der Nagellack getrocknet ist, verwenden Sie einen mit Aceton getränkten Wattestäbchen, um ihn von den letzten 200 Mikrometern der Spitze zu entfernen. Platin-Elektroden werden fertig gekauft und benötigen keine Vorbereitung.Bei diesem Verfahren verwenden wir die CUY six 10 P four dash one nepo Gen-Elektrode, um Plasmid-DNA mit einer Maxi-Präp oder einer vergleichbaren Methode zu reinigen, geben 100 Mikrogramm DNA in ein neues Röhrchen und fügen 10 Mikroliter 1 % Fast-Grün-Farbstoff hinzu. Mit TE wird das Volumen auf 100 Mikroliter aufgefüllt, um eine endgültige Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter Plasmid-DNA zu erreichen. Die Lösung wird vorsichtig durch Pipettieren gemischt und anschließend die DNA-Lösung fünf Minuten bei 14.000 U/min und Raumtemperatur zentrifugiert, um Verunreinigungen und Salze zu entfernen.Überführen Sie das SNAT in ein neues Röhrchen. Die DNA-Lösung kann während des gesamten Verfahrens bei Raumtemperatur im Röhrchen aufbewahrt werden. Anschließend befestigen Sie eine gezogene Nadel gemäß den Herstelleranweisungen an einem Mikromanipulator und tauchen die Nadelspitze in die DNA-Lösung ein, um die Nadel zu füllen.Stellen Sie den Mikromanipulator vorsichtig beiseite und bereiten Sie sich vor der Operation auf den Eingriff vor. Wiegen Sie eine trächtige Maus an embryonalen Tagen 9,5 bis 15,5, um das Körpergewicht zu bestimmen.Dann intraperitoneal. Injizieren Sie Natriumpentobarbital in pharmazeutischer Qualität in einer Dosis von 50 Mikrogramm pro Gramm Körpergewicht und warten Sie fünf Minuten. Alternativen zu Natriumpentobarbital könnten Ketamin, Xylazin, Injektionsanästhetika oder Gasanästhetika umfassen.Nach der Anästhesie verwenden Sie eine Rasierklinge und 50 %igen Ethanol, um das Haar vom Bauch zu rasieren. Desinfizieren Sie die Haut durch abwechselndes Einreiben mit Betadine und 70 %igem Alkohol. Führen Sie mit feinen Scheren einen Schnitt entlang der Bauchmitte durch.Ziehen Sie vorsichtig alle Uterushörner auf eine mit einer x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS angefeuchtete Mullkompresse, die um die Wunde herum platziert ist. Halten Sie den Uterus stets mit PBS feucht. Unter Verwendung eines flexiblen Lichtwellenleiterkabels.Legen Sie das Kabel unter das Uterushorn. Positionieren Sie die Gebärmutter zwischen dem Licht der Glasfaser und dem Daumen und drücken Sie vorsichtig, um den Embryo näher an die Uteruswand heranzuschieben. Wenn der Embryo so positioniert ist, dass der Kopf links liegt und nach oben gerichtet ist, führen Sie die Glaskapillare vorsichtig in das Zielventrikel ein und injizieren Sie etwa einen Mikroliter DNA-Lösung zur Elektroporation der kortikalen Schicht vier am embryonalen Tag 13,5.Platzieren Sie die Stab-Platinelektroden außerhalb des Uterus und geben Sie fünfmal rechteckförmige Stromimpulse mit 38 Volt für 50 Millisekunden ab. Wenn eine Mikro-Elektroporation verwendet wird, um am embryonalen Tag 10,5 den Thalamus oder Hypothalamus zu erreichen, führen Sie die feine Wolframelektrode (negative Elektrode) in das mit DNA injizierte Ventrikel und die Platinelektrode (positive Elektrode) in den Uterus ein. Positionieren Sie den Zielbereich zwischen den Enden beider Elektroden und geben Sie dreimal empfohlene rechteckförmige Stromimpulse mit sieben Volt für 100 Millisekunden ab.Nach Abschluss der Elektroporation wird der Uterushorn in seine ursprüngliche Lage zurückgebracht und 500 Mikroliter PBS hinzugefügt. Die innere Schicht der Inzision wird mit einem chirurgischen Faden genäht. Anschließend wird die äußere Schicht mit einer neun Millimeter langen automatischen Klammer verschlossen.Stellen Sie die Maus zwei Stunden lang auf eine Heizplatte, um sich von der Operation und der Anästhesie zu erholen. Die platinbasierte Elektroporation der kortikalen Region wird hier an embryonalen Tagen 13,5, 14,5 und 15,5 angewendet. Die Gehirne wurden nach der Geburt gewonnen.Tag sechs. Die Schicht der elektroporierten kortikalen Zellen unterscheidet sich deutlich von Experiment zu Experiment. Dies legt nahe, dass die zeitabhängige Elektroporation eine schichtspezifische Genfunktionserhöhung und -verlust im Kortex ermöglicht.Wie hier gezeigt, erfolgt die Elektroporation in tief liegendes Gewebe wie den Thalamus und Hypothalamus. Die Verwendung von Platinstab-Elektroden führt häufig zu geringer Effizienz; die Nutzung von Mikroelektroden zur Elektrooperation bietet bei diesen tiefen Geweben eine bessere Effizienz und Lebensfähigkeit.Wir injizierten eine Plasmadnlösung in das dritte Ventrikel von Mausembryonen. Am embryonalen Tag 11,5 führten wir eine Nadelelektroporation gezielt im Thalamus durch, da die meisten Thalamusexone bis zum sechsten Tag nach der Geburt in die Großhirnrinde projizieren. Hier zeigen wir die P-C-A-G-E-Y-F-P-Mikroelektroporation im sich entwickelnden Cephalon.Der Bereich des Thalamus wird durch RORC dargestellt, das alle postmitotischen thalamischen Neurone markiert. Mit weißen Pfeilen gekennzeichnete Axonprojektionen in die vierte Schicht der Großhirnrinde können ebenfalls mittels EYFP sichtbar gemacht werden, wobei EYFP das gesamte Neuron ausfüllt. Die Position der vierten Schicht in der Großhirnrinde wird zudem durch den RORC-Antikörper markiert.Einmal begonnen, kann diese Technik bei korrekter Durchführung innerhalb von 15 Minuten pro Liter durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Test sehr sorgfältig zu handhaben, um Schäden zu vermeiden. Andere Methoden, wie beispielsweise die Einfügung eines spezifischen Chromos in mtDNA, können durchgeführt werden, um den molekularen Mechanismus der Zellspezifikation nach der Entwicklung zu verstehen.Diese Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der Entwicklung des zentralen Nervensystems die Möglichkeit, die molekularen Mechanismen bei der Musterbildung, dem axonalen Wachstum und der Schaltkreisbildung zu untersuchen.

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