Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine effiziente Gen-Transfektion im zentralen Nervensystem embryonaler Mäuse zu einem gewünschten Entwicklungszeitpunkt und in einem bestimmten Bereich des Gehirns zu erzielen. Dies wird zunächst durch die Herstellung präziser Kapillaren und nadelförmiger Elektroden erreicht, um eine Schädigung des Uterus zu vermeiden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, eine einzigartige Methode zum Halten der Embryonen mithilfe eines Lichtleitkabels zu erlernen, um kleine Embryonen sichtbar zu machen und eine gezielte DNA-Injektion durchführen zu können.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Elektroporation mit stabförmigen Elektroden auf der Uterusoberfläche durchzuführen, um DNA in oberflächliche Bereiche des Gehirns einzubringen; der letzte Schritt des Verfahrens ist die Durchführung einer Elektroporation mit nadelförmigen Elektroden in tiefere Strukturen des Gehirns, wie beispielsweise den Thalamus und Hypothalamus. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine schichtspezifische Transfektion oder eine effiziente Transfektion im Thalamus zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der herkömmlichen In-utero-Elektroporation liegt in der besseren Sichtbarkeit und Kontrolle der Lage der Embryonen im Uterus.

Wir verwenden ein kabelähnliches Glasfasersystem, das es ermöglicht, Embryonen ab E 9,5 zu visualisieren, und Nadeln mit Hypodermis, um Plasmid-DNA in tiefere Bereiche des Gehirns, wie Thalamus und Hypothalamus, einzubringen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Gehirnentwicklung zu beantworten, wie neuronale Differenzierung, Gehirnmusterung und neuronale Vernetzung. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es schwer ist, die Nadel und die Elektroden zu formen und die korrekte Positionierung zu erreichen.

Die Gebärmutter und Embryonen Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um zu sehen, wie man präzise Nadelelektroden herstellt und wie man Embryonen zur Elektrofreisetzung positioniert. Da diese beiden Schritte für erfolgreiche Ergebnisse entscheidend sind. Zur Vorbereitung der Kapillaren verwenden Sie einen Mikropipettenzug gemäß den Herstelleranweisungen.

Bei diesem Verfahren verwenden wir einkammerige Glas-Kapillarrohre mit einem Durchmesser von einem Millimeter. Die gezogenen Nadeln sollten unter dem Stereomikroskop gemessen eine Länge von 800 Mikrometern bis einem Millimeter aufweisen und einen Außendurchmesser von weniger als 60 Mikrometern haben; anschließend werden die Nadelspitzen mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von 20 bis 30 Mikrometern abgeknipst. Jede Nadel sollte mit einem Messmikrometer vermessen werden.

Bereiten Sie als Nächstes Mikroelektroden durch Wickeln vor. Wickeln Sie ein Ende eines Wolframdrahts um einen vergoldeten Pin. Verwenden Sie Wolframdraht für negative Elektroden und Platindraht für positive Elektroden.

Befestigen Sie den Draht mit Param. am Stift. Stecken Sie anschließend den Draht in den Kunststoffstiel eines Wattestäbchens und wickeln Sie beide Enden gleichmäßig mit Phim ab. Schleifen Sie die Spitze des Drahtes mit feinem Schleifpapier sorgfältig zu, bis sie an der Spitze 20 bis 30 Mikrometer und zwischen 800 Mikometern und einem Millimeter von der Spitze entfernt 60 Mikrometer beträgt. Überprüfen Sie die endgültigen Abmessungen erneut mit einem Messmikrometer.

Als Nächstes tauchen Sie den geschärften Draht in einen Tropfen Nagellack, um eine dünne Schicht auf dem gesamten Draht zur Isolierung aufzutragen. Nachdem der Nagellack getrocknet ist, verwenden Sie einen mit Aceton getränkten Wattestäbchen, um ihn von den letzten 200 Mikrometern der Spitze zu entfernen. Platin-Elektroden werden fertig gekauft und benötigen keine Vorbereitung.

Bei diesem Verfahren verwenden wir die CUY six 10 P four dash one nepo Gen-Elektrode, um Plasmid-DNA mit einer Maxi-Präp oder einer vergleichbaren Methode zu reinigen, geben 100 Mikrogramm DNA in ein neues Röhrchen und fügen 10 Mikroliter 1 % Fast-Grün-Farbstoff hinzu. Mit TE wird das Volumen auf 100 Mikroliter aufgefüllt, um eine endgültige Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter Plasmid-DNA zu erreichen. Die Lösung wird vorsichtig durch Pipettieren gemischt und anschließend die DNA-Lösung fünf Minuten bei 14.000 U/min und Raumtemperatur zentrifugiert, um Verunreinigungen und Salze zu entfernen.

Überführen Sie das SNAT in ein neues Röhrchen. Die DNA-Lösung kann während des gesamten Verfahrens bei Raumtemperatur im Röhrchen aufbewahrt werden. Anschließend befestigen Sie eine gezogene Nadel gemäß den Herstelleranweisungen an einem Mikromanipulator und tauchen die Nadelspitze in die DNA-Lösung ein, um die Nadel zu füllen.

Stellen Sie den Mikromanipulator vorsichtig beiseite und bereiten Sie sich vor der Operation auf den Eingriff vor. Wiegen Sie eine trächtige Maus an embryonalen Tagen 9,5 bis 15,5, um das Körpergewicht zu bestimmen.

Dann intraperitoneal. Injizieren Sie Natriumpentobarbital in pharmazeutischer Qualität in einer Dosis von 50 Mikrogramm pro Gramm Körpergewicht und warten Sie fünf Minuten. Alternativen zu Natriumpentobarbital könnten Ketamin, Xylazin, Injektionsanästhetika oder Gasanästhetika umfassen.

Nach der Anästhesie verwenden Sie eine Rasierklinge und 50 %igen Ethanol, um das Haar vom Bauch zu rasieren. Desinfizieren Sie die Haut durch abwechselndes Einreiben mit Betadine und 70 %igem Alkohol. Führen Sie mit feinen Scheren einen Schnitt entlang der Bauchmitte durch.

Ziehen Sie vorsichtig alle Uterushörner auf eine mit einer x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS angefeuchtete Mullkompresse, die um die Wunde herum platziert ist. Halten Sie den Uterus stets mit PBS feucht. Unter Verwendung eines flexiblen Lichtwellenleiterkabels.

Legen Sie das Kabel unter das Uterushorn. Positionieren Sie die Gebärmutter zwischen dem Licht der Glasfaser und dem Daumen und drücken Sie vorsichtig, um den Embryo näher an die Uteruswand heranzuschieben. Wenn der Embryo so positioniert ist, dass der Kopf links liegt und nach oben gerichtet ist, führen Sie die Glaskapillare vorsichtig in das Zielventrikel ein und injizieren Sie etwa einen Mikroliter DNA-Lösung zur Elektroporation der kortikalen Schicht vier am embryonalen Tag 13,5.

Platzieren Sie die Stab-Platinelektroden außerhalb des Uterus und geben Sie fünfmal rechteckförmige Stromimpulse mit 38 Volt für 50 Millisekunden ab. Wenn eine Mikro-Elektroporation verwendet wird, um am embryonalen Tag 10,5 den Thalamus oder Hypothalamus zu erreichen, führen Sie die feine Wolframelektrode (negative Elektrode) in das mit DNA injizierte Ventrikel und die Platinelektrode (positive Elektrode) in den Uterus ein. Positionieren Sie den Zielbereich zwischen den Enden beider Elektroden und geben Sie dreimal empfohlene rechteckförmige Stromimpulse mit sieben Volt für 100 Millisekunden ab.

Nach Abschluss der Elektroporation wird der Uterushorn in seine ursprüngliche Lage zurückgebracht und 500 Mikroliter PBS hinzugefügt. Die innere Schicht der Inzision wird mit einem chirurgischen Faden genäht. Anschließend wird die äußere Schicht mit einer neun Millimeter langen automatischen Klammer verschlossen.

Stellen Sie die Maus zwei Stunden lang auf eine Heizplatte, um sich von der Operation und der Anästhesie zu erholen. Die platinbasierte Elektroporation der kortikalen Region wird hier an embryonalen Tagen 13,5, 14,5 und 15,5 angewendet. Die Gehirne wurden nach der Geburt gewonnen.

Tag sechs. Die Schicht der elektroporierten kortikalen Zellen unterscheidet sich deutlich von Experiment zu Experiment. Dies legt nahe, dass die zeitabhängige Elektroporation eine schichtspezifische Genfunktionserhöhung und -verlust im Kortex ermöglicht.

Wie hier gezeigt, erfolgt die Elektroporation in tief liegendes Gewebe wie den Thalamus und Hypothalamus. Die Verwendung von Platinstab-Elektroden führt häufig zu geringer Effizienz; die Nutzung von Mikroelektroden zur Elektrooperation bietet bei diesen tiefen Geweben eine bessere Effizienz und Lebensfähigkeit.

Wir injizierten eine Plasmadnlösung in das dritte Ventrikel von Mausembryonen. Am embryonalen Tag 11,5 führten wir eine Nadelelektroporation gezielt im Thalamus durch, da die meisten Thalamusexone bis zum sechsten Tag nach der Geburt in die Großhirnrinde projizieren. Hier zeigen wir die P-C-A-G-E-Y-F-P-Mikroelektroporation im sich entwickelnden Cephalon.

Der Bereich des Thalamus wird durch RORC dargestellt, das alle postmitotischen thalamischen Neurone markiert. Mit weißen Pfeilen gekennzeichnete Axonprojektionen in die vierte Schicht der Großhirnrinde können ebenfalls mittels EYFP sichtbar gemacht werden, wobei EYFP das gesamte Neuron ausfüllt. Die Position der vierten Schicht in der Großhirnrinde wird zudem durch den RORC-Antikörper markiert.

Einmal begonnen, kann diese Technik bei korrekter Durchführung innerhalb von 15 Minuten pro Liter durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Test sehr sorgfältig zu handhaben, um Schäden zu vermeiden. Andere Methoden, wie beispielsweise die Einfügung eines spezifischen Chromos in mtDNA, können durchgeführt werden, um den molekularen Mechanismus der Zellspezifikation nach der Entwicklung zu verstehen.

Diese Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der Entwicklung des zentralen Nervensystems die Möglichkeit, die molekularen Mechanismen bei der Musterbildung, dem axonalen Wachstum und der Schaltkreisbildung zu untersuchen.