Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung von okulären Pigmentepithelzellen aus Kaninchenauge
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 Ansichten • 4:17 Min. • July 8th, 2025
Pigmentepithelzellen sind terminale differenzierte quaderförmige Zellen, die durch Tight Junctions verbunden sind. Diese Epithelzellen, die die Iris auskleiden, sind die Irispigmentepithelzellen oder IPE-Zellen, und die in der Nähe der Netzhaut sind die retinalen Pigmentepithelzellen oder RPE-Zellen.
Um diese Zellen zu extrahieren, nehmen Sie ein intaktes Kaninchenauge. Behandeln Sie das Auge mit einem Desinfektionsmittel, um Mikroorganismen von der Augenoberfläche zu entfernen. Waschen Sie das Desinfektionsmittel mit einer Pufferlösung ab. Mache einen Schnitt in der Nähe der Iris. Machen Sie mit dieser Öffnung einen vollständigen kreisförmigen Schnitt entlang der Irisgrenze, wobei Sie das Auge in einen vorderen Abschnitt mit der Iris und einen hinteren Teil mit Netzhaut und Glaskörper teilen.
Nehmen Sie den vorderen Augenabschnitt und entsorgen Sie die Linse, um an die Iris zu gelangen. Entfernen Sie die Iris und legen Sie sie auf eine Kulturschale. Nehmen Sie anschließend das hintere Segment und entsorgen Sie den gallertartigen Glaskörper und die Netzhaut aus der Augenzwiebel.
Behandeln Sie die Iris und die Augenzwiebel mit Trypsin und inkubieren Sie. Trypsin baut die Tight Junction und die extrazellulären Matrixproteine ab und leitet die Dissoziation der Epithelzellen ein. Entsorgen Sie das Trypsin und fügen Sie ein geeignetes Nährmedium hinzu. Kratzen Sie vorsichtig die Oberfläche der Iris und des Augenbulbus ab, um die Epithelzellen im Medium freizusetzen.
Säen Sie schließlich die IPE- und RPE-Zellen in separate Vertiefungen. Die Zellen sind bereit für weitere nachgelagerte Assays.
Nachdem Sie das Tier eingeschläfert haben, verwenden Sie eine gebogene Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen zu entkernen, und reinigen Sie dann das restliche Muskelgewebe und die Haut von den Augen. Sammeln Sie die Augen in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen in die Laminar-Flow-Haube. Desinfizieren Sie sie, indem Sie sie zwei Minuten lang in eine Lösung auf Jodbasis tauchen, und geben Sie dann die Augen in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit sterilem PBS gefüllt ist.
Legen Sie ein Auge auf eine sterile Mullkompresse und halten Sie das Auge fest an den Sehnerv, dann schneiden Sie mit einem Skalpell #11 nahe der Grenze der Iris. Schneiden Sie mit einer Schere um die Iris herum, entfernen Sie das vordere Segment und legen Sie es in eine Petrischale, wobei Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper belassen, bis die retinalen Pigmentepithelzellen oder RPE-Zellen isoliert sind.
Um Irispigmentepithelzellen oder IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Iris heraus, die die IPE-Zellen enthält. Legen Sie die Iris in eine Petrischale und waschen Sie sie mit sterilem PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,25% Trypsin hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter des vollständigen Mediums hinzu und kratzen Sie das IPE vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette ab.
Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen in der Neubauer-Kammer und säen Sie 0,2 Millionen Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte mit 1 Milliliter vollständigem Medium aus. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Segment. Geben Sie die Zwiebeln in eine 24-Well-Platte, fügen Sie 500 Mikroliter 0,25 % Trypsin pro Auge hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter vollständiges Medium pro Kugel hinzu und kratzen Sie die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette ab.
Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit der Neubauer-Kammer und säen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben. Legen Sie die Platte in den Inkubator.
Übersicht
In diesem Artikel wird die Isolierung von Iris-Pigmentepithelzellen (IPE) und Netzhaut-Pigmentepithelzellen (RPE) aus Kaninchenaugen beschrieben. Das Verfahren umfasst eine sorgfältige Dissektion und enzymatische Behandlung, um die Zellen für weitere Assays zu dissociieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Augenheilkunde
Hintergrund
- Die Pigmentepithelzellen der Iris sind würfelförmig und terminal differenziert.
- Diese Zellen sind für verschiedene okulare Funktionen von entscheidender Bedeutung.
- Die Isolierung dieser Zellen ist für Forschungs- und therapeutische Anwendungen unerlässlich.
- Es sind geeignete Techniken erforderlich, um die Zellviabilität und -funktionalität aufrechtzuerhalten.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Isolierung von IPE- und RPE-Zellen bereitstellen.
- Downstream-Analysen für Forschungszwecke erleichtern.
- Das Verständnis des zellulären Verhaltens in okularen Geweben verbessern.
Verwendete Methoden
- Desinfektion und Vorbereitung der Kaninchenaugen.
- Präparation zur Trennung der vorderen und hinteren Augenabschnitte.
- Verwendung von Trypsin zur Dissoziation der Epithelzellen.
- Zellzählung und Aussaat in Kulturplatten zur Zellkultur.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von IPE- und RPE-Zellen aus Kaninchenaugen.
- Die Zellen waren vital und für weitere Assays geeignet.
- Das Protokoll zeigte Reproduzierbarkeit und Effizienz.
- Die Zellmorphologie blieb nach der Isolierung erhalten.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Isolierung von IPE- und RPE-Zellen.
- Diese Zellen können für verschiedene experimentelle Anwendungen verwendet werden.
- Zukünftige Studien können auf diesem Protokoll für weiterführende Forschung aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von okularen Pigmentepithelzellen ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Zielvalidierung für Netzhauterkrankungen, indem ein krankheitsrelevantes System für funktionelle Assays bereitgestellt wird. Diese Technik unterstützt die Assay-Entwicklung und phänotypische Bildschirmierung für therapeutische Strategien, die auf degenerative Netzhauterkrankungen abzielen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem primäre, menschenähnliche Zellen für Target-Engagement-Studien bereitgestellt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Signalwegen des Pigmentepithels der Iris und der Netzhaut.
- Operationaler Wert: Stellt terminal differenzierte Zellen für die funktionelle Zielvalidierung und biologische Risikominderung bereit.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Vorhersagesicherheit und die Portfolio-Priorisierung für Programme zu Augenerkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete funktionelle und genetische Assays vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Standardisierung von Assays, Reproduzierbarkeit und quantitative, zellbasierte Messergebnisse.
- Strategischer Wert: Verbessert die Bereitschaft für Screening-Verfahren und die Wiederverwendung von Plattformen zur Evaluierung von Wirkstoffen an okularen Zielstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung krankheitsrelevanter Systeme in der Forschung zur Netzhautdegeneration.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung unter Verwendung primärer Zellen.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch mechanistische Absicherung von Zielwegen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Forschung, indem sie primäre okuläre Epithelzellen für mechanistische und phänotypische Assays bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in der Biologie pigmentepithelialer Zellen.
- Screening: Bereitstellung von versuchsfertigen Zellen mit reproduzierbarer Isolierung und quantitativer Aussaat für die Wirkstoffprüfung.
- Analytik: Ermöglicht Zellzählung, Beurteilung der Vitalität und nachgeschaltete Messungen zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch krankheitsrelevante primäre Zellen zur Validierung retinaler Zielstrukturen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren Isolationsworkflow für eine konsistente Versorgung mit IPE- und RPE-Zellen über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei okularen Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Isolierung primärer Zellen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und verringertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen bei Netzhautprogrammen.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf funktioneller Zielvalidierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in okulärer Dissektion und Techniken der Primärzellkultur.
- Benötigt sterile Instrumente, Trypsin, Kulturmedien und Infrastruktur zur Zellzählung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Dissektions- und enzymatischen Dissoziationsprotokollen voraus.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen hinsichtlich des Umgangs mit verschiedenen okulären Geweben und artenspezifischen Variationen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie Gewebeverfügbarkeit und enzymatische Optimierung für eine konsistente Zellausbeute.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026