Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung von okulären Pigmentepithelzellen aus Kaninchenauge

Pigmentepithelzellen sind terminale differenzierte quaderförmige Zellen, die durch Tight Junctions verbunden sind. Diese Epithelzellen, die die Iris auskleiden, sind die Irispigmentepithelzellen oder IPE-Zellen, und die in der Nähe der Netzhaut sind die retinalen Pigmentepithelzellen oder RPE-Zellen.

Um diese Zellen zu extrahieren, nehmen Sie ein intaktes Kaninchenauge. Behandeln Sie das Auge mit einem Desinfektionsmittel, um Mikroorganismen von der Augenoberfläche zu entfernen. Waschen Sie das Desinfektionsmittel mit einer Pufferlösung ab. Mache einen Schnitt in der Nähe der Iris. Machen Sie mit dieser Öffnung einen vollständigen kreisförmigen Schnitt entlang der Irisgrenze, wobei Sie das Auge in einen vorderen Abschnitt mit der Iris und einen hinteren Teil mit Netzhaut und Glaskörper teilen.

Nehmen Sie den vorderen Augenabschnitt und entsorgen Sie die Linse, um an die Iris zu gelangen. Entfernen Sie die Iris und legen Sie sie auf eine Kulturschale. Nehmen Sie anschließend das hintere Segment und entsorgen Sie den gallertartigen Glaskörper und die Netzhaut aus der Augenzwiebel.

Behandeln Sie die Iris und die Augenzwiebel mit Trypsin und inkubieren Sie. Trypsin baut die Tight Junction und die extrazellulären Matrixproteine ab und leitet die Dissoziation der Epithelzellen ein. Entsorgen Sie das Trypsin und fügen Sie ein geeignetes Nährmedium hinzu. Kratzen Sie vorsichtig die Oberfläche der Iris und des Augenbulbus ab, um die Epithelzellen im Medium freizusetzen.

Säen Sie schließlich die IPE- und RPE-Zellen in separate Vertiefungen. Die Zellen sind bereit für weitere nachgelagerte Assays.

Nachdem Sie das Tier eingeschläfert haben, verwenden Sie eine gebogene Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen zu entkernen, und reinigen Sie dann das restliche Muskelgewebe und die Haut von den Augen. Sammeln Sie die Augen in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen in die Laminar-Flow-Haube. Desinfizieren Sie sie, indem Sie sie zwei Minuten lang in eine Lösung auf Jodbasis tauchen, und geben Sie dann die Augen in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit sterilem PBS gefüllt ist.

Legen Sie ein Auge auf eine sterile Mullkompresse und halten Sie das Auge fest an den Sehnerv, dann schneiden Sie mit einem Skalpell #11 nahe der Grenze der Iris. Schneiden Sie mit einer Schere um die Iris herum, entfernen Sie das vordere Segment und legen Sie es in eine Petrischale, wobei Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper belassen, bis die retinalen Pigmentepithelzellen oder RPE-Zellen isoliert sind.

Um Irispigmentepithelzellen oder IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Iris heraus, die die IPE-Zellen enthält. Legen Sie die Iris in eine Petrischale und waschen Sie sie mit sterilem PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,25% Trypsin hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter des vollständigen Mediums hinzu und kratzen Sie das IPE vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette ab.

Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen in der Neubauer-Kammer und säen Sie 0,2 Millionen Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte mit 1 Milliliter vollständigem Medium aus. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Segment. Geben Sie die Zwiebeln in eine 24-Well-Platte, fügen Sie 500 Mikroliter 0,25 % Trypsin pro Auge hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter vollständiges Medium pro Kugel hinzu und kratzen Sie die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette ab.

Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit der Neubauer-Kammer und säen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben. Legen Sie die Platte in den Inkubator.