Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung pigmentierter Epithelzellen aus isoliertem Schweineauge

Das Schweineauge enthält eine Population von quaderförmigen Epithelzellen, die zahlreiche Melanosomen enthalten - Organellen, die bei der Lichtabsorption helfen - was zu einem pigmentierten Aussehen dieser Zellen führt. Abhängig von der Lage dieser Zellen werden die unter der Netzhaut vorhandenen Epithelzellen als retinale Pigmentepithelzellen oder RPE-Zellen bezeichnet, und diejenigen, die die Iris auskleiden, werden als Irispigmentepithelzellen oder IPE-Zellen bezeichnet.

Um RPE- und IPE-Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme eines Schweineauges. Tauchen Sie das Auge in eine geeignete Desinfektionslösung, um alle Mikroben zu entfernen, die an der Augenoberfläche haften.

Entfernen Sie das Auge aus der Desinfektionslösung und machen Sie mit einer Nadel einen kleinen Schnitt in der Nähe der Iris. Verwenden Sie diese Öffnung, um einen vollständigen Umfangsschnitt entlang der Irisgrenze zu machen. Dadurch löst sich der irishaltige vordere Augenabschnitt vom hinteren Augenknollen, der die Netzhaut hat. Entfernen Sie den überschüssigen Teil und geben Sie die Iris und die Augenzwiebel in separate Kulturschalen.

Geben Sie ein geeignetes Nährmedium in die Platte mit der Iris und in den Augenbulbus. Kratzen Sie das Taschentuch ab. Durch die mechanische Kraft werden die Epithelzellen gelockert und an das Medium abgegeben. Aspirieren Sie die abgelösten IPE- und RPE-Zellen. Säen Sie sie in separate Kulturplatten und inkubieren Sie sie bis zur weiteren Verwendung.

Reinigen Sie das restliche Muskelgewebe und die Haut von den Augen, desinfizieren Sie die Augen in einer Lösung auf Jodbasis und spülen Sie sie mit PBS aus.

Um IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse und ziehen Sie die Iris heraus, wie gezeigt. Nachdem Sie zwei Iris vorbereitet haben, fügen Sie 1 Milliliter des vollständigen Mediums hinzu und isolieren Sie die Zellen, indem Sie sie mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette zerkratzen, dann die Zellen zählen und aussäen. Legen Sie die Platte in den Inkubator.

Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut aus dem hinteren Segment und legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale. Füllen Sie die Glühbirne mit 1 Milliliter Komplettmedium. Entfernen Sie mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteurpipette die RPE-Zellen, sammeln Sie die Zellsuspension mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette im Kolben und geben Sie sie zur Resuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zählen und säen Sie dann die Zellen und inkubieren Sie die Platte, wie zuvor gezeigt.