Ex-vivo-Lungenmodell von Schweinen: Eine Technik zur Entwicklung eines Lungenmodells zur Untersuchung bakterieller Biofilme auf bronchiolärem Gewebe von Schweinen

Bronchiolen sind die röhrenförmigen Atemwege der Lunge. Bei chronischen Infektionen verstopfen die Bronchiolen aufgrund der Ansammlung von Schleim. Der nährstoffreiche Schleim bietet eine geeignete Umgebung für das Wachstum opportunistischer Bakterien. Diese Bakterien werden in eine selbst produzierte extrazelluläre polymere Matrix eingebettet und vermehren sich zu einem Biofilm.

Um die Entwicklung eines bakteriellen Biofilms in der Lunge nachzuahmen, entnehmen Sie eine Probe aus bronchiolärem Gewebe eines Schweins in einer Petrischale. Präparieren Sie das Gewebe in Stücke in der gewünschten Form. Geben Sie ein Biofilm-Kulturmedium in die Petrischale. Sterilisieren Sie die Schale unter UV-Licht, um alle Oberflächenverunreinigungen zu entfernen.

Übertragen Sie die sterilisierten Gewebestücke in eine Multiwell-Platte, die Biofilm-Kulturmedien und Agarose-Pads enthält, die als optimales Substrat für die bakterielle Adhäsion dienen. Als nächstes stechen Sie eine Nadelspitze mit einer Kolonie der gewünschten Bakterien auf jedes Gewebestück, um Planktonbakterien in das Gewebe einzubringen. Versiegeln Sie die Platte mit einer UV-sterilisierten, porösen Membran, die einen gleichmäßigen Sauerstoffaustausch auf der gesamten Plattenoberfläche erleichtert. Inkubieren Sie die versiegelte Platte.

Während der Inkubation haften die Bakterien irreversibel durch Pili an der Epitheloberfläche und beginnen, die extrazelluläre Matrix zu sezernieren. Innerhalb der Matrix nutzen die Bakterien die Energiequellen Mucin und freie DNA aus den Nährmedien, um Biofilme zu bilden. Das bakterielle Biofilmmodell ist bereit für weitere Tests.

Legen Sie die Bronchiolen in die erste Wäsche mit DMEM/RPMI 1640. Lassen Sie es in der Wäsche und entnehmen Sie weitere Bronchiolenabschnitte aus derselben Lunge, um genügend Gewebeschnitte für das geplante Experiment zu erhalten. Legen Sie alle zusätzlichen bronchiolären Abschnitte aus derselben Lunge in die Wäsche und lassen Sie sie mindestens zwei Minuten lang in der Wäsche.

Entfernen Sie die Bronchiolen aus der ersten Wäsche und geben Sie die Proben in eine sterile Petrischale. Halten Sie jede Bronchiole leicht mit einer sterilen Pinzette fest und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu beschädigen. Entfernen Sie so viel weiches Gewebe wie möglich und schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Präparierschere in fünf Millimeter breite Streifen.

Legen Sie alle bronchiolären Gewebestreifen in die zweite Wäsche DMEM/RPMI 1640. Lassen Sie sie mindestens zwei Minuten in der Wäsche. Entfernen Sie dann die Gewebestreifen aus der zweiten Wäsche mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine saubere, sterile Petrischale. Entfernen Sie das restliche Weichgewebe, das an den Bronchiolen haftet, und schneiden Sie die Streifen mit einer sterilen Präparierschere in Quadrate.

Geben Sie die dritte Wäsche DMEM/RPMI 1640 in die Petrischale und mischen Sie die Taschentuchstücke in der Wäsche leicht, indem Sie die Schale schwenken. Gießen Sie die dritte Wäsche aus der Petrischale, ohne die Gewebestücke zu entfernen.

Fügen Sie dann die abschließende SCFM-Wäsche hinzu und stellen Sie sicher, dass alle Taschentuchstücke bedeckt sind. Sterilisieren Sie das Gewebe in SCFM unter UV-Licht für fünf Minuten. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um jedes sterilisierte bronchioläre Gewebestück in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu übertragen, die SCFM-Agarose-Pads enthält.

Um jedes Gewebestück mit dem gewünschten Bakterienstamm zu infizieren, berühren Sie eine auf einer Agarplatte gewachsene Kolonie mit der Spitze einer 29-Gauge-Nadel, die an einer sterilen 0,5-Milliliter-Insulinspritze befestigt ist. Berühren Sie dann die Kolonie auf dem Gewebestück und stechen Sie vorsichtig in die Oberfläche. Für die nicht infizierten Kontrollen stechen Sie vorsichtig mit der Nadelspitze in die Oberfläche des Gewebestücks.

Geben Sie dann mit einer Pipette 500 Mikroliter SCFM in jede Vertiefung. Sterilisieren Sie eine atmungsaktive Dichtungsmembran für jede 24-Well-Platte 10 Minuten lang unter ultraviolettem Licht. Entfernen Sie den Deckel von der 24-Well-Platte und ersetzen Sie ihn durch die atmungsaktive Membran. Inkubieren Sie die Platten dann bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln.