Mikrobioreaktorsystem aus flüssigem Marmor: Ein 3D-Kulturprotokoll für die Verkapselung von Schweineeizellen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 Ansichten • 3:29 Min. • July 8th, 2025
Bereiten Sie ein Bett aus fluoriertem Ethylenpropylen (FEP)-Pulver in einer Kulturschale vor. Geben Sie einen Tropfen Reifemedium mit Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) auf das FEP-Pulver. Rollen Sie den Tropfen vorsichtig über das Pulver, um eine flüssige Murmel oder LM zu bilden. Das FEP-Pulver bildet eine hydrophobe poröse Hülle, die den Gasaustausch zwischen der inneren Flüssigkeit und der Umgebung ermöglicht.
Sammeln Sie nun die LM-Einheit und geben Sie sie in die zentrale Vertiefung einer IVF-Petrischale. Geben Sie steriles Wasser in den äußeren Ring, um die KOKs mit Feuchtigkeit zu versorgen. Inkubieren Sie dann das LM unter physiologischen Bedingungen, um die Eizellreifung zu ermöglichen.
Als nächstes entfernen Sie das verbrauchte Medium und fügen ein frisches Reifemedium hinzu. Der direkte Flüssigkeitskontakt bricht die hydrophobe FEP-Hülle auf und bricht das LM, um die COCs freizusetzen. Übertragen Sie die freigesetzten COCs in eine neue Schüssel mit einem frischen Tropfen Reifemedium und waschen Sie sie, um FEP-Partikel zu entfernen.
Nach dem Waschen die KOK und das Frischmedium auf das FEP-Pulverbett geben. Rollen Sie den Tropfen, um ihn mit Puder zu bestreichen. Übertragen Sie schließlich das LM in die IVF-Petrischale. FEP-pulverbeschichtete LMs erhalten die 3D-Struktur der Eizellen und verbessern ihre Lebensfähigkeit.
Machen Sie ein Bett aus 5 Gramm FEP-Pulver in einer 30-Millimeter-Petrischale. Verteilen Sie einen einzelnen Tropfen Reifemedium mit 3 bis 5 KOK auf dem FEP-Pulver. Drehen Sie die Platte vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass die Partikel die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens vollständig bedecken und flüssige Murmeln oder LMs bilden.
Bereiten Sie mehrere 60-Millimeter-IVF-Petrischalen vor und geben Sie 3 bis 4 Milliliter steriles Wasser in die äußeren Ringe, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen. Nehmen Sie das geformte LM mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf und legen Sie es in die zentrale Vertiefung. Inkubieren Sie die Murmeln vier Tage lang bei 38 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.
Um das Medium zu wechseln, tragen Sie 30 Mikroliter Reifemedium auf jedes LM auf, wodurch es sich ausbreitet. Wenn sich der Marmorinhalt aufgelöst hat, werden die aus dem Bioreaktor freigesetzten KOK in einen Tropfen frisches Reifemedium in der Petrischale überführt. Nach 3 bis 4 Wäschen im Reifemedium werden die KOK zusammen mit 30 Mikrolitern Frischmedium auf das FEP-Pulverbett überführt.
Drehen Sie die Platte vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass die Pulverpartikel die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens vollständig bedecken und ein neues LM bilden. Übertragen Sie dann das LM in die IVF-Petrischale.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Oozytenreifung mithilfe von flüssigen Marmorstrukturen beschrieben, die aus Fluorethylenpropylen (FEP)-Pulver hergestellt werden. Die Technik verbessert die Vitalität von Cumulus-Oozyten-Komplexen (COCs) während der In-vitro-Fertilisation (IVF), indem die dreidimensionale Struktur erhalten bleibt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Reproduktionsbiologie
- In-vitro-Fertilisation
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Die Reifung der Oozyten ist entscheidend für eine erfolgreiche Befruchtung.
- Herkömmliche Methoden schützen die COCs während der Kultur möglicherweise unzureichend.
- Flüssigkeitsmarmorierungen bieten einen neuartigen Ansatz zur Verbesserung der Oozyten-Vitalität.
- PTFE-Pulver erzeugt eine hydrophobe Umgebung, die für den Gasaustausch geeignet ist.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Oozytenreifung unter Verwendung von FEP-Pulver.
- Beurteilung der Vitalität von COCs in flüssigen Marmorierungen.
- Verbesserung der Ergebnisse von IVF-Verfahren.
Verwendete Methoden
- Herstellung von FEP-Pulver in Kulturschalen.
- Bildung von flüssigen Marmorbällchen durch Abrollen von Reifungsmedium über FEP-Pulver.
- Bebrütung der flüssigen Marmorbällchen unter physiologischen Bedingungen.
- Waschen und Übertragen der COCs zur Erhaltung ihrer Integrität.
Hauptergebnisse
- FEP pulverbeschichtete flüssige Marmorbälle bewahren die 3D-Struktur von Oozyten.
- Die Methode verbessert die Vitalität von COCs während der Reifung.
- Erfolgreicher Transfer und Waschvorgang von COCs, ohne die Qualität zu beeinträchtigen.
Schlussfolgerungen
- Die Verwendung von flüssigen Marmorbällchen ist eine aussichtsreiche Technik zur Reifung von Oozyten.
- Diese Methode könnte die Erfolgsraten bei der In-vitro-Fertilisation verbessern.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die Bedingungen für verschiedene Arten zu optimieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die 3D-Kultur von Schweine-Oozyten mithilfe von flüssigen Marmeladen, die mit FEP-Pulver gebildet werden, und unterstützt die Oozytenreifung, während die strukturelle Integrität erhalten bleibt. Der Ansatz begegnet einer zentralen Herausforderung in der Forschung und Entwicklung der Fortpflanzungsbiologie: der Aufrechterhaltung der Vitalität des Cumulus-Oozyten-Komplexes während der in-vitro-Reifung. Durch Bereitstellung einer gasdurchlässigen, hydrophoben Mikroumgebung verbessert das System die Vorhersagegenauigkeit bei der Beurteilung der Oozytenqualität in Forschungspipelines zur Fruchtbarkeit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Oozytenreifungswegen unter physiologisch relevanten 3D-Bedingungen.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem die Struktur des Cumulus-Oozyten-Komplexes während der Kultur erhalten bleibt.
- Predictive Value: Steigert das Vertrauen in die Aussagekraft von Oozyten-Vitalitätsmessungen bei reproduktionstoxikologischen Untersuchungen und Fruchtbarkeitsscreenings.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening in der Fortpflanzungsgesundheit vor.
- Operativer Wert: Standardisiert die Oozyten-Einschließung, um reproduzierbare Reifungsergebnisse über alle Wiederholungen hinweg zu gewährleisten.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die Wiederverwendung der Plattform durch einfache Neubildung des Pulverbettes nach Mediumwechsel.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die krankheitsrelevante dreidimensionale Oozytenstruktur für translationsorientierte Biomarker-Studien in der reproduktiven Toxikologie.
- Operativer Wert: Ermöglicht die kontinuierliche Weiterentwicklung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung fruchtbarkeitsfördernder Wirkstoffe.
- Risikominderung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem falsch-negative Ergebnisse durch Oozytenschäden während der Kultur reduziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der flüssige Marmormikrobioreaktor passt in Workflows der frühen Entdeckungsforschung und unterstützt die Oozytenreifung vor der Beurteilung der Befruchtung oder vor Studien zur Wirkstoffexposition in Reproduktionstoxikologiesträngen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu Mechanismen der Oozytenreifung, indem die native 3D-Architektur erhalten bleibt.
- Screening: Stellt für die Wirkstoffbewertung bereitmache Oozyten mit gleichbleibender Vitalität und struktureller Integrität bereit.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Bestimmung von Reifungsraten, zytoplasmatischer Reifung und nuklearer Progression als zentrale Messgrößen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Weiterentwicklung, indem die Oozytenqualität für nachgeschaltete Befruchtungs- und Embryonalentwicklungsassays bewahrt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als modulares, reproduzierbares Verkapselungssystem, das für mehrere Oozytenreifungskampagnen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Modellen der Oozytenreifung, indem mechanische und chemische Belastungen verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt durch standardisierte Verkapselung und minimale manuelle Eingriffe Reproduzierbarkeit sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Weiterentwicklung und Einstellung bei der Wirkstoffscreening für Fruchtbarkeit, indem die Datenzuverlässigkeit gesteigert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikobewusste Priorisierung von Kandidaten für die Fortpflanzungsgesundheit auf Grundlage robuster Metriken zur Oozyten-Vitalität.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Reproduktionsbiologie und in Techniken zum Umgang mit Oozyten.
- Hängt vom Zugang zu FEP-Pulver und Inkubatoren mit kontrollierter Umgebung für die physiologische Kultur ab.
- Setzt eine standardisierte Schulung für die konsistente Bildung und Übertragung von Liquid Marbles voraus.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf Oozyten nicht-schweinespezifischer Arten angewendet wird.
- Ist durch die Notwendigkeit sorgfältigen Mediumaustauschs begrenzt, um eine vorzeitige Zerstörung des Marbles zu vermeiden.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026