Isolierung von porzinen Aortenadothelzellen (pAEC): Eine enzymbasierte Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus geernteten Bauchaorten von Schweinen

Die Aorta - die Hauptarterie, die sauerstoffreiches Blut vom Herzen zum Körper transportiert - besteht aus drei Schichten oder "Tuniken": einer inneren Intima, einer mittleren medial und einer äußeren Adventitia. Endothelzellen oder ECs liegen in der Intima als dünne, durchgehende Monoschicht über einer stützenden Basalmembran vor, die aus Strukturproteinen, hauptsächlich Kollagen, besteht.

Um ECs zu isolieren, beginnen Sie mit einer entnommenen Schweineaorta in einer Kulturschale. Schneiden Sie die Enden und das umgebende anhaftende Gewebe heraus, um eine Kontamination der nicht-endothelialen Zellen zu verhindern. Waschen Sie die Aorta mit einem Puffer, der Antibiotika enthält, um das mikrobielle Wachstum zu hemmen.

Führen Sie eine sterile chirurgische Naht durch die Aorta und binden Sie eines ihrer Enden zusammen, wobei die Naht im Lumen bleibt. Sichern Sie das gebundene Ende und ziehen Sie die Naht zurück, um die Aorta vollständig umzukehren. Dadurch wird die EC-haltige Intima einer enzymatischen Verdauung ausgesetzt. Behandeln Sie die Aorta mit vorgewärmter, niedrig konzentrierter Kollagenaselösung für eine optimale Enzymaktivität und inkubieren Sie.

Kollagenase baut die Kollagenproteine ab, die in der Basalmembran unter den ECs vorhanden sind, und leitet deren Dissoziation ein. Fügen Sie nach der Inkubation gekühlten Puffer hinzu, um die Kollagenaseenzyme zu inaktivieren.

Kratzen Sie vorsichtig die Oberfläche der Aortenintima ab und spülen Sie sie mit Puffer ab, um die ECs in Lösung zu bringen. Zentrifugieren Sie diese Lösung, um die ECs zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Medium. Die Zellsuspension wird in einen Kulturkolben gesät und inkubiert. Die ECs haften am Kolbenboden und vermehren sich.

Für die Isolierung von Endothelzellen der Schweineaorta wird die Schweineaorta unter aseptischen Bedingungen in eine 150-Millimeter-Petrischale überführt und beide Enden des Gefäßes vorsichtig entfernt. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe an der Stelle, an der das Gefäß festgeklemmt wurde, mit einer sterilen Pinzette und Schere ab und spülen Sie die Außen- und Innenseite der Aorta mit 20 bis 50 Millilitern frischem Waschpuffer ab.

Führen Sie als Nächstes eine chirurgische Naht durch die Aorta und binden Sie ein Ende des Gefäßes locker zusammen, wobei Sie die Naht im Lumen halten. Fixieren Sie die Aorta vorsichtig mit einer Pinzette in der Nähe des gebundenen Endes und ziehen Sie dann langsam an den chirurgischen Nähten, um die Aorta umzukehren, bis die endotheliale Oberfläche der Aorta freiliegt.

Waschen Sie die Endotheloberfläche der Aorta dreimal mit 10 Millilitern frischem Waschpuffer pro Waschgang und geben Sie die Aorta in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Decken Sie die Probe mit 10 Millilitern einer bei 37 Grad Celsius erwärmten 0,005%igen Kollagenase-IV-Verdauungslösung ab und inkubieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation überführen Sie den gesamten Röhrcheninhalt in eine 100-Millimeter-Kulturschale und stoppen den Aufschluss mit 10 bis 15 Millilitern vorgekühltem Stopppuffer. Entfernen Sie mit einem Zellschaber vorsichtig die Aorten-Endothelzellen von der Innenfläche des Gefäßes und waschen Sie das Gefäß dreimal mit 5 Millilitern Waschpuffer pro Waschgang.

Füllen Sie den Überstand nach dem letzten Waschen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um und waschen Sie den Boden der Kulturschale zweimal mit 5 Millilitern frischem Waschpuffer pro Waschgang, wobei Sie die Waschgänge im 50-Millimeter-Röhrchen sammeln.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entsorgen Sie alle bis auf die letzten 10 Milliliter Überstand. Fügen Sie 20 Milliliter Waschpuffer hinzu, um die Pellets wieder zu suspendieren, achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, und sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation.

Das Pellet wird zur Zählung in 1 Milliliter Zellkulturmedium resuspendiert und die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 bis 6 Zellen pro 25 Zentimeter quadratischem Kolben plattiert. Legen Sie dann die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Zellkultur-Inkubator und erneuern Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.