0 Aufrufe • 3:15 Min. • July 8th, 2025
Die Vitrifikation von Embryonen ist eine ultraschnelle Kryokonservierungstechnik, bei der Embryonen extrem schnell auf extrem niedrige Temperaturen abgekühlt werden, um ihre Langzeitlagerung zu erleichtern.
Nehmen Sie zunächst entnommene Kaninchenembryonen in geeigneten Medien. Inkubieren Sie die Embryonen mit einer Äquilibrierungslösung, die niedrige Konzentrationen von zelldurchdringenden Kryoprotektivien enthält - Ethylenglykol oder EG und Dimethylsulfoxid oder DMSO. EG und DMSO diffundieren durch die Zellmembranen, ersetzen Wassermoleküle im Zellinneren und verhindern die Bildung intrazellulärer Eiskristalle.
Als nächstes inkubieren Sie die Embryonen mit Vitrifikationslösung, die höhere Konzentrationen von EG und DMSO enthält, um eine ausreichende Permeation der Kryoprotektiva und einen ausreichenden intrazellulären Wasserausfluss zu ermöglichen und die Zellen vor Frostschäden zu schützen.
Koppeln Sie einen sterilen kryogenen Strohhalmträger an einen Mikrospender. Füllen Sie den Strohhalm mit dem Mikrospender bis zum entsprechenden Füllstand mit dem gewünschten Medium. Aspirieren Sie dann eine Luftblase, gefolgt von einem minimalen Volumen der embryohaltigen Vitrifikationslösung und einer weiteren Luftblase.
Saugen Sie das Medium erneut an, bis die erste Medienfraktion den pulverbeschichteten Wattestopfen gerade benetzt und polymerisiert und das Ende des Strohhalms versiegelt. Verschließen Sie das andere Ende mit einem hydrophoben Strohstopfen. Die Luft- und Mediensegmente helfen bei der Isolierung von Embryonen innerhalb des geschlossenen Trägers.
Tauchen Sie den Strohhalm kurz in flüssigen Stickstoff bei -196°C. Der Träger sorgt für hohe Kühlraten und verfestigt die Embryonen in eine glasartige amorphe Phase, während das geringe Volumen der verwendeten Vitrifikationslösung und Kryoprotektiva den osmotischen Stress abschwächt. Die vitrifizierten Embryonen können mit ausgesetzter Stoffwechselaktivität bis zur Verwendung gelagert werden.
Für die embryonale Vitrifikation tauchen Sie die Embryonen 2 Minuten lang in Äquilibrationslösung, gefolgt von einer 1-minütigen Inkubation in Vitrifikationslösung. Am Ende der Inkubation laden Sie die Embryonen in einen 125-Mikroliter-Plastikbehälter und koppeln Sie das geschlossene Ende des Strohhalms mit einem geeigneten 1-Milliliter-Mikrospender. Die Basis medium bis zu einem Drittel der Strohhalmlänge ansaugen, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
Als nächstes wird ein Stereomikroskop verwendet, um die Embryonen in 40 Mikrolitern Vitrifikationslösung zu aspirieren, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase in genügend Basismedium, um die erste flüssige Fraktion bis zum Baumwollende des Ministrohs zu bewegen. Verschließen Sie dann das geöffnete Ende des Ministrohs mit einem Strohstopfen, tauchen Sie das Ministroh direkt in flüssigen Stickstoff, um eine Verglasung zu erreichen, und lagern Sie das Ministroh in einem Flüssigstickstoff-Dewar.