All-in-One-CRISPR-Genom-Editing: Eine Methode für den homologiegesteuerten reparaturbasierten Gen-Knock-in in kultivierten Zellen mit dem CRISPR-Cas9-System

Beginnen Sie mit der Zugabe von All-in-One-CRISPR-Plasmid zu Immunzellen, die in einem Röhrchen vorhanden sind. Dieses Plasmid enthält ein Cas9-Gen in Kombination mit der sgRNA- oder Single-Guide-RNA-kodierenden Sequenz, komplementär zur Zielsequenz im Wirtsgenom.

Fügen Sie ein linearisiertes Donorplasmid hinzu, das ein Transgen enthält, das zwischen Homologiearmen oder HAs eingebettet ist - die DNA-Wiederholungen, die für die homologe Rekombination erforderlich sind. Führen Sie eine Elektroporation durch, bei der elektrischer Strom verwendet wird, um das Plasmidgemisch in die Zelle zu injizieren. Im Inneren bildet die prozessierte sgRNA einen Komplex mit der exprimierten Cas9-Nuklease.

Die sgRNA bindet an die Zielstelle, so dass die Cas9-Nuklease die spezifische Erkennungssequenz, die als Protospacer-Nachbarmotiv oder PAM bekannt ist, identifizieren und die Wirts-DNA in der Nähe spalten kann. Dies führt zu einem stumpfen Doppelstrangbruch, bei dem die zelluläre Maschinerie die DNA reseziert und 3'-Überhänge erzeugt. Das Vorhandensein von HA-Flankierungsstellen löst den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus aus, bei dem sich die geschnittene DNA mit der HA-Sequenz verbindet und eine Heteroduplex-Struktur bildet - die D-Schleife.

Die

DNA-Synthese setzt sich fort und bildet einen Strang, der zur Transgensequenz komplementär ist, bis er sich wieder mit dem ursprünglichen DNA-Strang verbindet. Die Oberseite der D-Schleife dient als Vorlage für die Synthese des fehlenden Teils der DNA, wodurch die doppelten Holliday-Verbindungen erzeugt werden - Strukturen, in denen vier DNA-Stränge interagieren. Diese Verbindungen lösen sich auf und die Lücken reparieren sich, was die Insertion des Zielgens erleichtert.

Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern vollständigem Wachstumsmedium ohne Antibiotika in jeder Vertiefung vor. Wärmen Sie die Platte in einem befeuchteten 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vor. Schalten Sie das Elektroporationssystem ein. Eingabe von Elektroporationsparametern für JURKAT- oder RAW-Zellen.

Bereiten Sie das Zell-DNA-Gemisch für die Elektroporation vor. Die Kultur der JURKAT-Zellen wird in einem 25-Quadratzentimeter-Kolben gesammelt. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 90 x g acht Minuten lang bei Raumtemperatur pelletiert.

Was die Überstände betrifft, so resuspendieren Sie die Zellen zum Waschen mit 5-ml-DPBS. Schleudern Sie dann die Zellsuspension durch Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Schritt. Entfernen Sie das DPBS und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 mL DPBS. Verwenden Sie 10 Mikroliter Zellsuspension und mischen Sie mit einem gleichen Volumen von 0,2 % Trypanblau.

Um die Zellzahl zu schätzen, laden Sie die Probe in diese Zählfolie. Fügen Sie die Zählfolie in den automatischen Zellzähler ein, sehen Sie sich das Bild der Zellen an und erhalten Sie dann ein Zellzählergebnis. Berechnen Sie 2 Millionen Zellen für 5 Wiederholungen der Elektroporation pro Knock-in-Experiment.

Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Pelletzellen durch Zentrifugation. Um Zeit zu sparen, kann während des Zentrifugationsschritts ein Elektroporationsgemisch hergestellt werden. Geben Sie jeweils 2,5 Mikrogramm des CRISPR-Cas9-Vektors, 2,4 Mikrogramm des linearisierten Targeting-Vektors und des Resuspensionspuffers R zu einem Gesamtvolumen von 55 Mikrolitern in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.

Vorsichtig vortexen und kurz schleudern, um sich gut zu vermischen. Lassen Sie die Elektroporationsmischung vor Gebrauch bei Raumtemperatur. Nach dem Schleudern das DPBS ansaugen und weitere 30 Sekunden zentrifugieren. So viel Überstand wie möglich entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen durch Zugabe der vorbereiteten Elektroporationsmischung. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab.

Elektroporation: Verwenden Sie für die Zellelektroporationsmischung eine 10-Mikroliter-Nukleofektionsspitze mit Pipette.

Wichtig: Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren, da dies zu einem Ausfall der Elektroporation führt. Drücken Sie auf "Start".

Nach der Elektroporation wird die Probe in eine Vertiefung von 24-Well-Platten mit vorgewärmtem Wachstumsmedium überführt. Führen Sie die gleichen Elektroporationsverfahren wie oben an den verbleibenden 4 Replikatproben durch. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen 48 bis 72 Stunden lang in einem 37-Grad-Inkubator, bevor Sie die FACS-Zellen sortieren.