Zinkfinger-Nuklease-basierte Genomeditierung: Eine Technik zur Modifikation des Genoms in menschlichen pluripotenten Stammzellen durch doppelsträngigen homologieabhängigen Reparaturmechanismus

Die Zinkfingernuklease oder ZFN enthält eine Zinkionen-stabilisierte, DNA-bindende Makrodomäne, die über einen Linker mit einer Endonuklease-Domäne verbunden ist. Diese Struktur trägt dazu bei, die Spezifität zu erhalten, während die DNA geschnitten wird.

Um ZFNs für die Genomeditierung zu verwenden, nehmen Sie eine Kultur mit menschlichen pluripotenten Stammzellen. Ergänzen Sie es mit einem Plasmid, das für ZFN kodiert. Fügen Sie ein Reparaturplasmid hinzu, das das Zielgen und das Antibiotikaresistenzgen enthält, das zwischen Homologiearmen oder HAs eingebettet ist. Elektropopolieren Sie das Zell-DNA-Gemisch, wobei der elektrische Strom den Eintritt von Plasmiden in die Zelle erleichtert.

Sobald sie sich im Inneren befinden, binden die Zinkfingermotive von translatiertem ZFN an die Tripletts komplementärer Basenpaare im Wirtsgenom und positionieren die Fok-1-Restriktionsendonuklease korrekt an der Zielstelle. ZFNs binden paarweise an gegenüberliegende Stränge, wodurch die Fok-1-Homodimerisierung ein aktives katalytisches Zentrum bilden kann, in dem Fok-1 DNA-Doppelstrangbrüche oder DSBs erzeugt, die einen Vier-Nukleotid-Überhang erzeugen.

Das Vorhandensein von HAs im Reparaturplasmid steuert die homologieabhängige Reparatur, bei der das überhängende Ende invertiert und die homologe HA-Sequenz als Vorlage verwendet. Die DNA-Synthese setzt sich fort, indem Nukleotide hinzugefügt werden, die zum Zielgen komplementär sind.

Die entstehenden Lücken werden ligiert, was die Geninsertion erleichtert. Zusätzlich wird das promotorlose Antibiotikaresistenzgen von einem Wirtspromotor stromaufwärts der Insertionsstelle exprimiert. Erfolgreich editierte Zellen wachsen im Antibiotika-Auswahlmedium.

Beginnen Sie mit der Kultivierung humaner pluripotenter Stammzellen in hES-Medien auf einer 6-Well-Platte, die Mitomycin-C-inaktivierte Maus-Embryonale Fibroblasten (MEF) enthält, Feeder-Zellen, die auf Gelatine gezüchtet wurden. Verwenden Sie jeden folgenden Tag nach dem Plattieren, bis der hPS-Wert eine Konfluenz von 50 % erreicht hat, eine Glaspipette und ein Vakuum, um das gesamte Medienvolumen zu entfernen. Ersetzen Sie es durch 3 Milliliter warmes hESC-Medium pro Vertiefung.

Entfernen Sie einen Tag vor dem Targeting das hESC-Medium und fügen Sie frisches, vorgewärmtes hESC-Medium hinzu, das mit 10 Mikromolaren Y27632 ergänzt wird. Bereiten Sie außerdem ein bis zwei 6-Well-Platten mit arzneimittelresistenten MEF-Feederzellen von DR4-Mäusen vor. Bereiten Sie die Transfektionslösungen am Tag der Zielbestimmung vor, indem Sie 5 Mikrogramm Zinkfinger-Nuklease-Expressionsplasmid 1 und 2 in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pipettieren.

Fügen Sie 30 Mikrogramm des Reparaturspenderplasmids hinzu, gefolgt von ausreichend 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das Volumen auf 300 Mikroliter zu bringen. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um eine Konfluenz von 50 % sicherzustellen. Verwenden Sie anschließend eine Glaspipette und ein Vakuum, um das Medium von der Platte der hPS-Zellen zu entfernen. Waschen Sie dann die Zellen mit 2 Millilitern warmem 1X PBS. Nach dem Aspirieren des PBS werden 0,5 Milliliter 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung direkt auf die Zellen gegeben.

Stellen Sie die Dose für ca. 10 Minuten in den Gewebekultur-Inkubator oder bis sich die Feederschicht von der Platte zu heben beginnt. Geben Sie nach der Inkubation 2 Milliliter warmes esWash-Medium in jede Vertiefung, um die Trypsinreaktion zu stoppen. Sammeln Sie die Zellen aus jeder Vertiefung und stellen Sie sicher, dass sich die Feeder-Zellen als Blatt lösen. Pipettieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung in ein einzelnes konisches 50-Milliliter-Röhrchen, kombinieren Sie alle Vertiefungen, und zerkleinern Sie die Zellen mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette.

Fügen Sie esWash Media hinzu, um die Zellsuspension auf 40 Milliliter zu bringen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis sich große Feeder-Stücke am Boden des Röhrchens absetzen können, entfernen Sie dann den Überstand mit einer serologischen Pipette und geben Sie ihn in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 190 x g zentrifugiert wurde, wird der Überstand aspiriert, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern 1X PBS.

Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen mit der zuvor hergestellten Plasmatransfektionslösung. Pipettieren Sie die Zellen und das Transfektionsgemisch in eine 4-Millimeter-Elektroporationsküvette und legen Sie sie drei bis fünf Minuten lang auf Eis. Stellen Sie die Parameter für das Exponentialprogramm am Elektroporationssystem auf 250 Volt, 500 Mikrofarad, unendlichen Widerstand und 4 Millimeter Küvettengröße ein. Elektroporieren Sie die Zellen und legen Sie die Küvette dann wieder für drei Minuten auf Eis.

Resuspendieren Sie die elektroporierten Zellen in 18 Millilitern warmem hESC-Medium, das mit 10 mikromolaren Y27632 ergänzt wird. Untersuchen Sie die DR4 MEFs unter dem Mikroskop. 3 Milliliter der einzelligen Suspension werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, die DR4-Feederzellen enthält, gegeben und in den Inkubator zurückgeführt. Ersetzen Sie am dritten Tag nach der Beschichtung das Medium auf den Zellen durch hESC-Medien ohne Y27632. Ersetzen Sie an Tag 4 die nicht supplementierten Medien durch Medien, die das entsprechende Auswahlantibiotikum enthalten. Hier kommt Puromycin zum Einsatz.