JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 2:15 Min. • July 8th, 2025
Nanoblades sind synthetische virusähnliche Partikel ohne das verkapselte virale Erbgut, was sie zu geeigneten Trägern für fremde Fracht in die Wirtszellen macht. Diese Nanoklingen werden aus dem retroviralen Kern des Maus-Leukämievirus hergestellt, der von der Lipid-Doppelschichtmembran umgeben ist, die von den eukaryotischen Produzentenzellen abgeleitet wird, die zum Zusammenbau von Nanoklingen in vitro verwendet werden.
Der Kern enthält das Cas9-Enzym, das mit der sgRNA komplexiert ist, die für die Zielgenomsequenz spezifisch ist. Kernproteine sind von den Hüllproteinen umgeben, die eine Transmembrandomäne oder TM enthalten, die durch die Lipiddoppelschicht verläuft. Das TM bindet an eine extrazelluläre Glykoprotein-Oberflächendomäne oder SU, die aus der Doppelschichtschicht herausragt.
Um Nanoblades für die Geneditierung zu verwenden, nehmen Sie eine Kultur mit adhärenten Zielzellen und ergänzen Sie sie mit der Nanoblade-Lösung. In der Kultur erkennt das hervorstehende SU einer Nanoklinge den entsprechenden Rezeptor auf der Oberfläche der Wirtszelle und bindet an diesen. Dies führt zu Änderungen in der SU-Domänenstruktur, die die Freigabe erleichtern.
Diese Veränderungen lösen die Konformationsänderungen in der TM-Domäne aus, die dann an die Wirtsmembran bindet. Diese Bindung bringt die Nanoklinge in die Nähe der Wirtszelle, was die Verschmelzung der viralen Doppelschichtmembran mit der Wirtsmembran ermöglicht, und der Viruskern bewegt sich in das Zytoplasma.
Im Inneren der Zelle zerfällt der Kern und setzt den Cas9-sgRNA-Komplex frei, der an seinem Zielort eine Genomeditierung durchführen kann.
Für die Transduktion von Zielzellen mit Nanoklingen ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 500 Mikroliter des Mediums, das gereinigte Nanoklingen enthält. Ersetzen Sie nach vier bis sechs Stunden Zellinkubation das Medium durch die normale Menge an frischem Medium.