Hydrodynamischer Gentransfer: Eine Technik zur In-vivo-Transfektion von exogener DNA in murinen Hepatozyten durch Injektion von Schwanzvenen

Um den hydrodynamischen Gentransfer durchzuführen, nehmen Sie zunächst eine Spritze, die mit einer Lösung auf Kochsalzlösung gefüllt ist, die rekombinante Plasmide enthält, die das gewünschte Gen tragen. Nehmen Sie anschließend ein Mausmodell und injizieren Sie schnell eine große Menge Plasmidlösung an der Basis des Schwanzes, wobei Sie sicherstellen, dass die Plasmidlösung intravenös in die Schwanzvene injiziert wird.

Die unter Druck stehende Injektion eines großen Volumens von Plasmiden erzeugt eine mechanische Kraft, die als hydrodynamische Kraft bezeichnet wird und den intravaskulären Druck in der unteren Hohlvene erhöht - einer Vene, die sauerstoffarmes Blut zum Herzen transportiert.

Ein großes Flüssigkeitsvolumen führt zu einer Stauung im rechten Ventrikel des Herzens und erzwingt die Umkehrung in die Blutrichtung. Dieser Schritt zwingt die Plasmidlösung, in die Lebervene einzudringen, die sie zur Leber transportiert.

Die Plasmide bewegen sich in den Lebersinusoiden - den Räumen in der Leber, die von den Endothelzellen ausgekleidet sind. Ein erhöhtes Blutvolumen hilft den Plasmiden, die Endothelschicht zu permeabilisieren, und hilft ihnen, in die Nähe der umgebenden Hepatozyten - der Leberzellen - zu gelangen.

Der schnelle Zufluss der Plasmidlösung induziert Druck auf die Zellmembran der Hepatozyten, wodurch transiente Poren entstehen. Diese Poren erleichtern die Aufnahme der Plasmid-DNA durch die Zellen. Später schließen sich die Membranporen und schließen die Plasmide in den Hepatozyten ein.

Die erfolgreiche Expression des interessierenden Gens in den Hepatozyten bestätigt die Transfektion.

Beginnen Sie mit dem Wiegen der Mäuse und bereiten Sie dann eine sterile Kochsalzlösung vor, die 15 Mikrogramm pro Milliliter salzlösungsfreies endotoxinfreies Dornröschen-Vektorkonstrukt und 1 Mikrogramm pro Milliliter endotoxinfreies pc-HSB5 enthält. Bereiten Sie genügend Lösung vor, um jeder Maus ein Volumen zu injizieren, das 10 % ihres Körpergewichts entspricht. Füllen Sie eine sterile 3-Milliliter-Spritze mit dem erforderlichen Volumen für eine Maus und setzen Sie eine 27-Gauge-Nadel ein.

Nachdem Sie eine angemessene Menge Seidenpapier hinzugefügt haben, um nur wenig Platz für Bewegung, aber genügend Platz zum Atmen zu lassen, führen Sie die Maus in einen geeigneten Fixierapparat mit Atemlöchern ein. Erwärmen Sie den Schwanz mit einer Infrarotlampe für 30 bis 60 Sekunden, während Sie sorgfältig auf Anzeichen von Überhitzung achten, wie z. B. schnelle Bewegungen des Schwanzes oder andere Anzeichen von Unruhe, und reinigen Sie dann den Schwanz mit einem Alkoholtupfer.

Führe die Nadel fast waagerecht in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen in der Nähe des Schwanzansatzes ein. Bei erfolgreicher Platzierung kann eine kleine Menge Blut in den Nadelkegel zurückfließen. Injizieren Sie das gesamte Volumen innerhalb von 8 bis 10 Sekunden in die Schwanzvene. Entfernen Sie die Maus nach der Injektion sofort aus dem Rückhaltesystem. Komprimieren Sie die Injektionswunde mindestens 30 Sekunden lang mit steriler Gaze oder bis die Blutung nachlässt.

Eine erfolgreiche hydrodynamische Schwanzveneninjektion ist entscheidend für die Transfektion und hängt insbesondere von der Geschwindigkeit, dem Volumen und der Zeit der Injektion ab. Um die intravenöse Injektion zu erleichtern, stellen Sie sicher, dass die Mäuse am Tag der Injektion nicht gestresst oder dehydriert sind.

Bringen Sie die Maus nach 30 bis 60 Minuten in einem Bergungskäfig wieder in ihren ursprünglichen Käfig zurück.