Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation: Eine Methode zur genetischen Transformation des Reisgenoms mittels gentechnisch verändertem Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens, ein pflanzenpathogenes Bakterium, kann gentechnisch verändert werden, indem ein künstlich hergestelltes Ti-Plasmid eingeführt wird, das ein Gen trägt, das für seine Transfer-DNA oder T-DNA-Region von Interesse ist, und ein Helferplasmid, das die Virulenz- oder Vir-Gene für die Übertragung der T-DNA in Pflanzenzellen trägt.

Agrobacterium vermittelte genetische Transformation beginnen Sie mit einem jungen Reisblütenstand und schneiden Sie ihn in kleine Stücke. Übertragen Sie die Stecklinge auf ein Wachstumsmedium und inkubieren Sie, um das Wachstum der Stecklinge zu einer undifferenzierten Zellmasse, der sogenannten Kallus, zu erleichtern.

Übertragen Sie nun den Kallus in ein Agrobacterium-Infiltrationsmedium, das Acetosyringon enthält - einen Chemolockstoff für Agrobacterium. Als nächstes fügen Sie dem Medium eine Kultur mit gentechnisch verändertem Agrobacterium hinzu und inkubieren Sie kurz.

Die Acetosyringon-Moleküle aktivieren das Zellrezeptorprotein - VirA - auf der Agrobacterium-Membran, das die Phosphorylierung eines transkriptionellen Aktivatorproteins - VirG - weiter vermittelt. Phosphoryliertes VirG bewegt sich in Richtung des Helferplasmids und aktiviert die Transkription einer Kaskade von Virulenzgenen, einschließlich Kanalproteinen und Endonukleasen - VirD1 und VirD2.

Die Kanalproteine bilden einen Transportkanal, der die Bakterien- und Pflanzenzelle verbindet, während die Endonukleasen an die Grenzsequenzen im Ti-Plasmid binden und die T-DNA mit VirD2 spalten, das an einem Ende gebunden ist. Danach steuert VirD2 den Eintrag der T-DNA über den Transportkanal in die Kalluszellen und erleichtert deren Integration in das Reisgenom.

Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70%igen Alkoholtupfer ab und lassen Sie ihn trocknen, bevor Sie ihn schneiden. Bringen Sie den Blütenstand auf einen sterilen Labortisch und schneiden Sie ihn mit einer sterilisierten Schere in kleine Stücke. Übertragen Sie dann die Stecklinge auf eine Petriplatte, die NBD2-Medium enthält.

Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 Grad Celsius für 10 bis 14 Tage, um Hornhaut zu induzieren. Um die Transformation durchzuführen, wird eine einzelne Kolonie von der YEB-Platte mit selektiven Antibiotika in ein konisches steriles Reagenzglas von 50 Millilitern auf 5 Milliliter flüssiges YEB-Medium übertragen, das die gleichen Antibiotika enthält. Schütteln Sie das Röhrchen auf einem Orbitalschüttler bei 250 x g und 25 bis 28 Grad Celsius, bis die Bakterien auf einen OD₆₀₀ von 0,5 anwachsen.

Man gib 1 Milliliter Bakteriensuspension zu 100 Millilitern YEB-Medium mit den gleichen selektiven Antibiotika in einen 250-Milliliter-Konuskolben und schüttle den Kolben auf einem Orbitalschüttler bei 250 x g und 28 Grad Celsius für vier Stunden. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bakterien zu sammeln. Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit AAM-AS-Medium resuspendiert und die Suspension auf OD₆₀₀ von 0,4 verdünnt.

Nach der Inkubation werden etwa 150 gesunde, hellgelbe, embryogene Calli in einen sterilen 150-Milliliter-Kolben gegeben. Geben Sie 50 bis 75 Milliliter der bakteriellen Zellsuspension in den Kolben und fügen Sie dann 10 bis 25 Milliliter frisches AAM-AS-Medium hinzu, um die Calli 10 bis 20 Minuten lang unter gelegentlichem Schütteln einzutauchen.

Gießen Sie die Bakteriensuspension vorsichtig aus dem Kolben und trocknen Sie die Calli mit sterilem Filterpapier ab. Legen Sie sie dann auf eine Petrischale mit NBD-AS-Medium und decken Sie sie mit Filterpapier ab. Inkubieren Sie die Calli drei Tage lang bei 25 bis 28 Grad Celsius im Dunkeln und überprüfen Sie sie auf bakterielle Überwucherung.

Nach drei Tagen Co-Kultivierung geben Sie die Calli mit Filterpapier in eine sterile Petrischale und trocknen sie dann zwei Stunden lang an der Luft auf einer sauberen Bank. Vergewissern Sie sich, dass die Calli nicht mit dem Filterpapier verklebt sind, und übertragen Sie sie auf das primäre Auswahlmedium NBD2.

Nach zwei Wochen die Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium geben. Bewegen Sie dann die Calli zur Differenzierung in frisches MS-Medium und die Sprossknospen in MS-Medium (mit 10 mg/l Hygromycin), um mehr Triebe zu vermehren.