JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:59 Min. • July 8th, 2025
Für die elektroporationsbasierte Verabreichung von Plasmid-DNA in primäre neuronale Zellen beginnen Sie mit einer Suspension der Zellen in geeigneten Elektroporationsmedien. Fügen Sie fluoreszierende Protein-kodierende Plasmid-DNA hinzu, um die Elektroporationsmischung vorzubereiten.
Übertragen Sie das Elektroporationsgemisch vorsichtig in eine Elektroporationsküvette und vermeiden Sie dabei Luftblasen, die die Elektroporationseffizienz negativ beeinflussen könnten. Übertragen Sie die Küvette in den Küvettenhalter des Elektroporators. Stellen Sie die Elektroporationsparameter ein. Initiieren Sie die Elektroporation.
Die angelegten kurzen elektrischen Hochspannungsimpulse über die Zellmembran verursachen eine differentielle Ladungsakkumulation auf beiden Seiten der Membran, wodurch das Transmembranpotential, die Spannung über die Zellmembran, erhöht wird.
Wenn das induzierte Transmembranpotential das Abbaupotenzial der Lipiddoppelschicht übersteigt, destabilisiert sich die Lipiddoppelschicht mit der lokalisierten Konfigurationsänderung und bildet vorübergehende hydrophile Poren auf der Zellmembran. Die Poren mit ausreichender Größe bieten einen Weg für Plasmid-DNA, um in das Zytoplasma der Zelle einzudringen.
Nach Abschluss der Elektroporation verschließt sich die Lipiddoppelschicht wieder, wodurch die Integrität der Zellmembran-Doppelschicht wiederhergestellt wird, wodurch die Plasmid-DNA eingeschlossen wird. Während der Phase des Zellzyklus, in der die Kernmembran, die den Zellkern umgibt, zerlegt wird, wird die Plasmid-DNA in den Zellkern transloziert.
Galvanisierte Zellen werden in medienhaltige Vertiefungen einer Multi-Well-Platte mit proteinbeschichteten Deckgläsern plattiert. Inkubieren, damit die Zellen an dem proteinbeschichteten Deckglas haften können. Erfolgreich transfizierte Zellen, die Plasmid-DNA enthalten, exprimieren die fluoreszierenden Proteine.
Geben Sie zunächst 0,5 Milliliter Nährmedium in jede Wand der 24-Well-Kulturplatte mit beschichteten Deckgläsern und halten Sie sie in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius warm. Pipettieren Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 x g.
Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Opti-MEM. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um sicherzustellen, dass sich kein Restkulturmedium im Röhrchen befindet. Stellen Sie die Parameter der Elektroporation wie aufgeführt ein. Pipettieren Sie die Elektroporationsreaktion vorsichtig, um sie gut zu vermischen, und übertragen Sie mit einer langen P200-Pipettenspitze ein genaues Volumen von 100 Mikrolitern der Mischung in die Küvette mit einem Abstand von zwei Millimetern.
Sobald sich die Küvette in der Küvettenkammer befindet, drücken Sie die Omega-Taste des Elektroporators und notieren Sie den Impedanzwert, indem Sie ein genaues Volumen von 100 Mikrolitern einhalten. Der Bereich der Impedanzwerte sollte ungefähr 30 und 35 betragen.
Drücken Sie die Start-Taste, um den Impuls zu starten. Notieren Sie die gemessenen Stromwerte und die auf dem Leserahmen angezeigten Steine. Nehmen Sie die Küvette aus der Kammer.
Geben Sie sofort 100 Mikroliter vorgewärmtes Nährmedium in die Küvette und resuspendieren Sie es, indem Sie es zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension sofort auf die zuvor vorbereitete 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator.