Nukleofektion von Parasitenformen: Eine auf Elektroporation basierende Transfektionsmethode zur Abgabe von fluoreszierenden Protein-kodierenden Plasmiden in den Sporozoitenkern

Um Plasmide durch Nukleofektion in Sporozoitenkerne zu bringen, beginnen Sie mit einer Suspension isolierter, lebensfähiger Sporozoiten - bewegliches, infektiöses Stadium der Parasiten - in Puffer. Sporozoiten sind schlanke Zellen, die von einer äußeren Plasmamembran und einem darunter liegenden inneren Membrankomplex umgeben sind, der aus einer Reihe von abgeflachten Vesikeln und Proteinen besteht, die für die strukturelle Stabilität und Beweglichkeit entscheidend sind.

Zentrifugieren Sie die Suspension, um die Sporozoiten zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Sporozoit-Pellet in einem geeigneten Volumen nukleärer Transfektionspuffer, ergänzt mit fluoreszierenden Protein-kodierenden Plasmiden. Der nukleare Transfektionspuffer mit hoher Pufferkapazität und Ionenstärke gewährleistet eine effiziente Transfektion bei gleichzeitiger Beibehaltung der Sporozoitenfunktionalität.

Die Suspension wird in eine nukleare Transfektionsküvette überführt. Legen Sie die Küvette in die Halterung eines Nukleofektionsgeräts. Führen Sie das entsprechende Nukleofektionsprogramm aus.

Während der Nukleofektion stören spezifisch applizierte kurze Hochspannungsimpulse zusammen mit Pufferbestandteilen vorübergehend die Plasmamembran und den inneren Membrankomplex und bilden Transmembranporen, die den Plasmiden den Zugang zum Zytoplasma ermöglichen.

Gleichzeitig stören diese hochstarken elektrischen Felder auch die doppelschichtige Kernmembran, die den Zellkern umgibt und vorübergehende Lücken entwickelt, die den direkten Eintritt von Plasmiden in den Zellkern erleichtern, ohne dass eine Zellteilung erforderlich ist.

Sobald die Nukleofektion abgeschlossen ist, verschließen sich die Poren der Zell- und Kernmembran wieder, wodurch die Integrität der Membran und die Homöostase wiederhergestellt werden, während die Plasmide im Zellkern eingeschlossen werden.

Nehmen Sie die Küvette aus dem Gerät. Geeignetes Medium für die Sporozoitengewinnung zugeben und in ein frisches Röhrchen überführen. Erfolgreich nukleofezierte Sporozoiten mit Plasmid-DNA exprimieren fluoreszierende Proteine.

Zuerst werden die Sporozoiten oder Merozoiten-Suspension 10 Minuten lang bei 600 x g zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen. In der folgenden Reihenfolge werden 85 Mikroliter nukleärer Transfektionspuffer, 10 Mikrogramm Plasmid und 25 Einheiten Restriktionsenzym in das 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben, das Sporozoiten oder Merozoite enthält. Die Suspension in einen nuklearen Transfektionsbecher überführen.

Setzen Sie den Becher in eine nukleare Transferrille ein, schalten Sie das Nukleofektionsgerät mit dem Netzschalter ein und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033. Wenn das Programm beendet ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm zeigt OK an, was anzeigt, dass die Nukleofektion erfolgreich war. Geben Sie 0,5 bis 1 Milliliter Modifiziertes Eagle's Medium von Dulbecco in den Nukleofektionbecher, um die Reaktion zu stoppen.

Nach dem vorsichtigen Mischen die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.