Retrovirale vermittelte Gentransduktion: Eine Gentransfertechnik zur Verabreichung eines Transgens in kultivierten Zellen unter Verwendung von gentechnisch veränderten retroviralen Vektoren

Um Wirtszellen mit RNA zu transduzieren, die retrovirale Vektoren enthält, nehmen Sie ein Röhrchen mit verpackten Vektoren in geeignetem Medium. Jeder Vektor enthält ein virales Kapsid, das das RNA-Komplement des Transgens enthält, das in das Wirtsgenom integriert werden soll, sowie wichtige virale Enzyme. Eine Lipiddoppelschicht umgibt das Kapsid, um den Eintritt in die Wirtszelle zu erleichtern.

Die Vektoren werden in Gegenwart eines geeigneten Transfektionsreagenzes in die Vertiefung einer Kulturplatte gegeben, die die Wirtszellsuspension enthält. Decken Sie den Teller ab. Zentrifugieren Sie mit niedriger Geschwindigkeit, um eine Spintransduktion zu ermöglichen. Dadurch wird der virale Vektor näher an die Oberfläche der Wirtszelle gebracht, was die Transduktionseffizienz erhöht.

Gleichzeitig neutralisieren die Polykationen im Transfektionsreagenz negative Ladungen auf dem Virus und der Wirtszelle und fördern so die virale Adsorption an die Zielzellen.

Rezeptoren auf der Virusoberfläche erleichtern daher die Fusion mit der Wirtsmembran. Das virale Kapsid dringt in die Zelle ein und reißt auf, wobei transgene RNA und virale Enzyme in das Zytoplasma freigesetzt werden.

Im Zytoplasma wandelt die virale reverse Transkriptase die RNA in eine einzelsträngige komplementäre DNA um und wandelt sie später in doppelsträngige provirale DNA um. Die resultierende DNA gelangt in den Zellkern. Das virale Integrase-Enzym vermittelt die Integration proviraler DNA in das Wirtsgenom, was zu transduzierten Zellen führt.

Sammeln Sie frischen Virusüberstand aus der Zelllinie des Virusproduzenten. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen gut verteilt sein und eine definierte Morphologie aufweisen. Als nächstes aspirieren Sie vorsichtig die oberen 2 Milliliter des Mediums aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte, die die Knochenmarkzellen enthält. Vermeiden Sie es, die Knochenmarkzellen zu aspirieren, die normalerweise in der Mitte der Vertiefung konzentriert sind.

Geben Sie 3 Milliliter frisch ergänzten Virusüberstand in jede Vertiefung der 6-Well-Platte, die Knochenmarkzellen enthält. Nachdem Sie die Platten in Plastik eingewickelt haben, wiederholen Sie die Spintransduktion und legen Sie dann die unverpackten Platten in den Gewebekultur-Inkubator. Entfernen Sie nach 24 Stunden am dritten Tag 2 Milliliter des Mediums aus den Vertiefungen und setzen Sie es wieder ein.