JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 2:44 Min. • July 8th, 2025
Die Lebersteatose ist ein pathologischer Zustand, der durch eine übermäßige Ansammlung von Fetten in den Hepatozyten - einem prominenten Leberzelltyp - gekennzeichnet ist. Die Fette lagern sich in Form von unterschiedlich großen Lipidtröpfchen im Zytoplasma der Hepatozyten ab.
Strukturell enthält ein Lipidtröpfchen einen Kern aus neutralen, hydrophoben Fetten wie Triglyceriden und Cholesterinestern. Der Kern ist von einer Phospholipid-Monoschicht umgeben, die mit verschiedenen Proteinen verziert ist.
Um die Fettablagerung zu visualisieren, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die eine adhärente Hepatozytenkultur enthält. Die Zellen werden mit einem steatogenen Medium vorbehandelt, um die Ansammlung von Lipidtröpfchen in ihnen zu induzieren.
Fügen Sie die gewünschte Konzentration von Paraformaldehyd hinzu, das in die Zellen diffundiert und die Proteine vernetzt. Dieser Schritt deaktiviert die Proteasen und erhält die Hepatozytenstruktur. Verwerfen Sie das Paraformaldehyd und fügen Sie die Öl-Rot-O-Lösung hinzu, die den in Isopropanol gelösten organischen Farbstoff enthält.
Das Isopropanol fungiert als Trägerlösungsmittel für die schwer löslichen Öl-Rot-O-Moleküle. Dies hilft den Farbstoffmolekülen, in fixierte Hepatozyten einzudringen und schließlich die Lipidtröpfchen zu erreichen. Im Inneren geht der Farbstoff aufgrund seiner höheren Affinität vom Isopropanol auf neutrale Lipide über und bildet den Farbstoff-Lipid-Komplex. Dies führt zu einer roten Färbung der Lipidtröpfchen.
Entsorgen Sie den überschüssigen Farbstoff und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Die intrazellulären Lipidtröpfchen erscheinen intensiv rot.
Legen Sie in jede Vertiefung in einer 24-Well-Platte ein Zellkulturdeckglas und säen Sie HepG2-Zellen aus, wie im Textmanuskript beschrieben. Waschen Sie die Zellen nach der entsprechenden Inkubation mit 1 Milliliter PBS und entsorgen Sie den Überstand. Fixieren Sie sie mit 1 Milliliter 4% Paraformaldehyd in PBS und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das überschüssige Paraformaldehyd und spülen Sie die Zellen mit 1 Milliliter destilliertem Wasser.
Fügen Sie dann 1 Milliliter 70% Isopropanol hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang. Entsorgen Sie das überschüssige Isopropanol, fügen Sie 1 Milliliter Öl-Rot-O-Lösung hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Entsorgen Sie die überschüssige Öl-Rot-O-Lösung und spülen Sie sie dann mit 1 Milliliter destilliertem Wasser ab. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei einer 400-fachen Vergrößerung.