JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:10 Min. • July 8th, 2025
Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) sind die wichtigsten zellulären Bestandteile in der Tunica media - der mittleren Schicht der Blutgefäßwand. Als Reaktion auf pathologische Signale oder Alterung vermitteln diese Zellen die Gefäßverkalkung - ein Phänomen der Kalziumansammlung in der extrazellulären Matrix.
Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die eine adhärente Schicht aus vorverkalkter, muriner Aorten-VSMC-Kultur enthält. Inkubieren Sie die Zellen mit Formalinlösung, um zelluläre Proteine zu vernetzen und die VSMC-Struktur vor der Färbung zu stabilisieren.
Beginnen Sie mit der Von-Kossa-Färbung, indem Sie Formalin aus der Vertiefung aspirieren und Silbernitratlösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte unter einer geeigneten Lichtquelle.
Sobald die Silbernitratlösung die Verkalkungsstellen in der extrazellulären Matrix der VSMC-Schicht erreicht, ersetzen die Silberionen die an Phosphat gebundenen Kalziumionen. Dies führt zu einer vorübergehenden gelben Färbung. In Gegenwart von organischer Substanz und Licht führt der photochemische Abbau von Silberphosphat zu einer schwarz gefärbten metallischen Silberbildung.
Entsorgen Sie die maximale Menge der verbrauchten Silbernitratlösung. Behandeln Sie die Zellen mit Natriumthiosulfatlösung. Diese Lösung wandelt restliche Silbersalze in einen wasserlöslichen Komplex um, der durch eine abschließende Spülung mit Wasser entfernt werden kann, wodurch der Färbekontrast verbessert wird.
Bilde die gefärbten Zellen, um die unlöslichen schwarzen Ablagerungen zu lokalisieren, die auf Verkalkung hinweisen.
Um eine Verkalkung in den glatten Gefäßmuskelzellen zu induzieren, übertragen Sie die Zellen auf die sechswellige Kulturplatte und lassen Sie sie anhaften. Als nächstes füttern Sie die Zellen wieder mit Verkalkungsmedien. Inkubieren Sie die Zellen mindestens sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend aspirieren Sie das Medium von der Zellkulturplatte. Waschen Sie die Zellen einmal in entionisiertem Wasser.
Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang in 1 Milliliter 10% Formalin bei Raumtemperatur legen. Entfernen Sie dann das Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
Inkubieren Sie die Zellen anschließend 1 bis 2 Stunden lang in 1 Milliliter 5%iger Silbernitratlösung unter einer 60- bis 100-Watt-Glühbirne. Anschließend die Silbernitratlösung absaugen und 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser waschen. Entfernen Sie nach 5 Minuten das nicht umgesetzte Silber, indem Sie die Zellen 5 Minuten lang in 1 Milliliter 5%ige Natriumthiosulfatlösung in destilliertem Wasser legen. Spülen Sie anschließend die Zellen 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser aus. Die mit von Kossa gefärbten Zellen sind nun bereit für die Bildgebung mit der üblichen Inverslichtmikroskopie.