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Für die zellzytoplasmaspezifische Färbung in Weichteilmikroumgebungen erhalten Sie eine frisch entnommene Mausniere. Behandeln Sie es mit einer Fixierlösung, die Formaldehyd, Eisessig und Methanol enthält. Inkubieren Sie bei niedrigen Temperaturen.
Formaldehyd dringt in die Zellen ein und vernetzt Proteine mit Proteinen und Proteine mit Nukleinsäuren. Methanol verdrängt Wasser aus dem Gewebe und gerinnt Proteine. Essigsäure bewirkt eine intrazelluläre Übersäuerung und Gewebeschwellung und wirkt so der durch Methanol verursachten Gewebeschrumpfung entgegen.
Die Fixierung inaktiviert Enzyme und stabilisiert die Gewebemorphologie für die nachfolgende Färbung. Entfernen Sie überschüssige Fixiermittel mit Puffer. Inkubieren Sie das Gewebe mit Eosin Y, einem sauren Farbstoff.
Eosin dringt in fixierte Zellen ein und gelangt in das Zytoplasma. Das saure Milieu des Zytoplasmas, das durch die Behandlung mit Essigsäure entsteht, bewirkt eine maximale Protonierung der Aminogruppen zytoplasmatischer Proteine.
Eosin, mit negativ geladenen funktionellen Gruppen, interagiert elektrostatisch mit protonierten Proteingruppen, bildet einen stabilen Farbstoff-Protein-Komplex und färbt das Zytoplasma bei der Akkumulation rosa. Schneiden Sie nach der Inkubation die gefärbte Niere in kleine Stücke, gefolgt von einer Dehydrierung des Gewebes in zunehmender Ethanolkonzentration
.
Betten Sie das Nierengewebe in Paraffinwachs ein. Erhalten Sie dünne Gewebeschnitte mit einem Mikrotom. Rehydrieren Sie außerdem die Schnitte für die mikroskopische Analyse.
Ungefärbte Zellkerne erscheinen weiß vor einem rosa gefärbten Zytoplasma, was die Visualisierung von Nierenmikrostrukturen ermöglicht, wie z. B. proximale gewundene Tubuli, die aus Epithelzellen mit Bürstenrändern bestehen, oder Sammelkanäle, die mit abgeflachten Epithelzellen ohne Bürstenränder ausgekleidet sind.
Beginnen Sie mit der Fixierung der Weichteilproben. Füllen Sie ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit einer Fixierlösung, die 9,5 Milliliter 4 % Formaldehyd und 0,5 Milliliter Eisessig enthält. Geben Sie die Weichteilprobe in das Zentrifugenröhrchen und kühlen Sie es 24 bis 72 Stunden lang.
Waschen Sie die Weichteilprobe nach dem Abkühlen 1 Stunde lang mit DPBS-Lösung. Färben Sie dann die Probe, indem Sie sie in 2 Milliliter Eosin-Y-Färbelösung legen und 24 Stunden lang auf einer horizontalen Schüttelplatte inkubieren.
Nehmen Sie am nächsten Tag die Weichteilprobe vorsichtig aus dem Probenbehälter und entfernen Sie überschüssiges Färbemittel mit Zelluloseseidenpapier. Legen Sie es zur Lagerung und weiteren Verwendung in einen konischen Behälter über einer Ethanoldampfphase.