Safranin-O-Färbung: Eine Methode zur Visualisierung der strukturellen Integrität und Zellularität von Knorpel

Beginnen Sie für die Knorpelfärbung mit einem formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Knorpelschnitt von einer euthanasierten Maus.

Tauchen Sie die Probe zunächst in den Xylol-Ersatz - ein ungefährliches Reinigungsmittel, das das Paraffinwachs entfernt und das dehydrierte Gewebe freilegt. Behandeln Sie die Probe anschließend mit abnehmenden Ethanolkonzentrationen, um das Gewebe für die anschließende Färbung zu rehydrieren.

Färben Sie nun die Probe mit dem Weigert-Eisen-Hämatoxylin - einem organischen Farbstoff, der Eisenionen enthält - und inkubieren Sie kurz. Die Hämatoxylin-Moleküle bilden Komplexe mit Eisenionen und dringen in die Zelle ein. Die Eisenionen wirken als Beizmittel und erleichtern die Bindung des Hämatoxylins an die Nukleinsäuren, wodurch diese eine blaue Farbe erhalten.

Behandeln Sie die Probe dann mit dem schnellen grünen Farbstoff - einer Gegenfärbung, die sich an das Bindegewebe bindet und eine grüne Farbe verleiht. Behandeln Sie die Probe anschließend mit einer Essigsäurelösung, um die Farbstoffmoleküle zu stabilisieren. Zum Schluss wird die Probe mit Safranin-Orange - einem kationischen Farbstoff - gefärbt und inkubiert.

Die positiv geladenen Safranin-Moleküle wandern zu den negativ geladenen Proteoglykanen im Knorpel und binden an diese, wodurch sie eine rote Farbe erhalten. Anschließend montieren Sie den Objektträger in ein Harzmedium und visualisieren ihn unter einem Mikroskop.

Gesunder Knorpel erscheint aufgrund der proteoglykanreichen extrazellulären Matrix intensiv rot, während ungesunder Knorpel mit Anzeichen von Gewebeschäden weniger rot erscheint.

Um eine Safranin-O-Färbung durchzuführen, entparaffinieren Sie die Objektträger zunächst drei bis fünf Minuten lang in Oxylen und wiederholen Sie das Oxylenbad zweimal. Hydratisieren Sie dann die Objektträger in einem Ethanolgradienten und enden mit destilliertem Wasser. Legen Sie dann die Objektträger durch Weigerts Eisen-Hämatoxylin-Lösung, eine 0,05%ige Fast Green-Lösung, eine 1%ige Essigsäurelösung und eine 0,1%ige Safranin-O-Lösung. Montieren Sie nun die Objektträger mit einem harzigen Medium.