Periodische Säure-Schiff-Färbung von Zellen: eine in vitro Technik zum Nachweis des Glykogenspiegels in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) sind zirkulatorische Blutzellen mit einzelnen, großen Zellkernen, die aus B- und T-Lymphozyten, natürlichen Killerzellen, Monozyten und dendritischen Zellen bestehen. PBMCs speichern überschüssige Glukose in polymerer Form als Glykogen - ein verzweigtes Polysaccharid - in ihrem Zytoplasma.

Um das Vorhandensein von Glykogen in PBMCs nachzuweisen, erstellen Sie einen einheitlichen Abstrich der isolierten PBMCs auf einem Objektträger. Behandeln Sie die Zellen mit Formalin - einer Fixierlösung, die zelluläre Biomoleküle vernetzt und so die strukturelle Integrität der PBMCs bewahrt.

Tauchen Sie den Objektträger teilweise in Amylaselösung. Dieses Enzym dringt in die Zellen ein und hydrolysiert das Glykogen in den behandelten Zellen. Daraus ergeben sich zwei unterschiedliche Zellpopulationen - enzymbehandelte, glykogendefiziente und nicht Amylase-behandelte, glykogenreiche Zellen.

Überlagern Sie sie mit periodischer saurer Lösung, die die Hydroxylgruppen der Glykogenmoleküle oxidativ in Aldehyde umwandelt.

Spülen Sie den Objektträger mit Wasser ab, um die Oxidationsreaktion zu stoppen und überschüssige periodische Säure zu entfernen. Behandeln Sie den Objektträger mit Schiff-Reagenz, das mit den Aldehydgruppen des periodisch säurebehandelten Glykogens reagiert und einen unlöslichen magentafarbenen Komplex erzeugt.

Wenden Sie Eindeckmedien an, um die Zellen während der Bildgebung zurückzuhalten. Platzieren Sie ein Deckglas, um das Montagemedium zur besseren Visualisierung über die gesamte Folienoberfläche zu verteilen. Stellen Sie sich die gefärbten Zellen vor.

Nicht mit Amylase behandelte Zellen enthalten magentafarbene Glykogengranula, die in enzymbehandelten Zellen nicht vorhanden sind.

Legen Sie in diesem Schritt die Folie auf eine ebene Fläche. Tragen Sie 2 Milliliter Periodische Säurelösung auf die Probe auf und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie dann den Objektträger mehrmals mit destilliertem Wasser ab. Tragen Sie 2 Milliliter des Schiff-Reagenzes auf den Objektträger auf und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Folie anschließend 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen. Tragen Sie als Nächstes 100 Mikroliter Montagemedium auf den Objektträger auf und decken Sie ihn mit einem großen Deckglas ab, oder tragen Sie 50 Mikroliter auf und verwenden Sie zwei kleine Deckgläser. Tragen Sie danach Klarlack auf die Ränder des Deckglases auf. Lass sie über Nacht trocknen.

Nehmen Sie dann Bilder mit dem Binokularlichtmikroskop mit dem 100X-Objektiv auf.