JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 2:50 Min. • July 8th, 2025
Periphere Nerven bestehen aus Axonen, die von Schwann-Zellen umgeben sind, die sich mit mehreren Schichten lipidreicher Zellmembranen um die Axone wickeln und die Myelinscheide bilden.
Um periphere Nerven zu visualisieren, beginnen Sie mit einem Objektträger, der einen festen, in Harz eingebetteten, mit Osmiumtetroxid behandelten peripheren Nervenschnitt der Ratte trägt. In Harz eingebettete Schnitte helfen, die Gewebemorphologie zu erhalten.
Die Behandlung mit Osmiumtetroxid bewirkt die Ablagerung von metallischem Osmium in der Lipidschicht der Myelinscheide an der Gewebestelle.
Pipettieren Sie eine alkalische Lösung von Toluidinblau über den Gewebeschnitt. Trocknen Sie den Objektträger bei einer geeigneten Temperatur. Die alkalischen Bedingungen und die Hitze erleichtern das Eindringen von Toluidinblau durch das Harz in den Gewebeschnitt.
Toluidinblau, ein kationischer Farbstoff, bindet an die negativ geladenen Phosphatgruppen auf der DNA und interkaliert auch zwischen den DNA-Basenpaaren in Schwann-Zellkernen. Darüber hinaus bindet der Farbstoff an RNA im Zytoplasma, außerhalb der Myelinscheide.
Geben Sie eine Eindecklösung über den gefärbten Nervenabschnitt und bedecken Sie ihn mit einem Deckglas, um das Gewebe für die Bildgebung vorzubereiten. Unter dem Lichtmikroskop erscheinen die Myelinscheidenschichten nach der Osmiumbehandlung schwarz mit definierten myelinisierten Nervenfaserstrukturen, während die Axone ungefärbt bleiben.
Die Zellkerne und das Zytoplasma der Schwann-Zellen weisen aufgrund der metachromatischen Eigenschaft des Farbstoffs unterschiedliche Blautöne auf, was die Visualisierung der Axonmorphologie und des Myelinisierungsgrades in peripheren Nerven erleichtert.
Um die Nervenabschnitte zu färben, verwenden Sie eine Plastikpipette oder eine Mikropipette, um einen Tropfen Toluidinblau-Lösung auf die Oberseite der Nervenabschnitte zu geben. Spülen Sie nach 20 bis 30 Sekunden alle überschüssigen Toluidinblau-Lösungen ab, indem Sie die Objektträger vorsichtig in ein Glas mit deionisiertem Wasser tauchen und dies 3 bis 4 Mal wiederholen, bis die Abschnitte klar sind.
Trocknen Sie die Objektträger mindestens 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius oder über Nacht bei Raumtemperatur. Nach dem Trocknen normales Eindeckmedium hinzufügen und die Abschnitte mit einem Deckglas abdecken. Untersuchen Sie abschließend die montierten Sektionen unter einem Lichtmikroskop. Für detaillierte Bilder zur Berechnung der g-Verhältnisse wird eine 100-fache Ölimmersionslinse empfohlen.