$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Um Knorpel- und Knochenregionen in einem Gewebeschnitt zu visualisieren, beginnen Sie mit einem Objektträger mit einem dünnen Abschnitt aus gefrorenem Mausembryogewebe
.
Tauen Sie die Kryosektion kurz auf und tauchen Sie sie in eine geeignete Ethanolkonzentration, um das Kryo-Einbettungsmedium zu entfernen. Der Entfernungsschritt hilft, ein Lösen des Mediums zu verhindern, das sonst die Gewebevisualisierung während der Färbung beeinträchtigen könnte. Darüber hinaus fixiert Ethanol das Gewebe und erhält die Morphologie und Integrität des Gewebes.
Pipettieren Sie anschließend eine kresylviolette Lösung auf das Gewebe. Cresylviolett, ein positiv geladener, basischer Farbstoff, bindet an polyanionische Anteile wie Proteoglykane in der Knorpelgewebematrix. In mineralisiertem Gewebe wie Knochen reagiert es dagegen mit negativ geladenen Gruppen wie Phosphatgruppen in der Knochenmatrix.
Da es sich um einen metachromatischen Farbstoff handelt, färbt Kresylviolett verschiedene Regionen des Gewebes in Farben, die sich vom natürlichen Farbstoff unterscheiden, basierend auf seiner Wechselwirkung mit verschiedenen chemischen Bestandteilen innerhalb dieser Regionen.
Waschen Sie nun das Tuch in einer geeigneten Ethanolkonzentration, um überschüssige Flecken zu entfernen. Tauchen Sie das Gewebe in steigende Ethanolkonzentrationen, um das Wasser aus dem Gewebe zu ersetzen und das Gewebe zu dehydrieren. Waschen Sie das Gewebe mit Xylol, um Ethanol zu verdrängen und das Gewebe für die Mikroskopie transparent zu machen.
Unter dem Lichtmikroskop erscheint das Knorpelgewebe magentafarben, während das Knochengewebe braun erscheint, was die Unterscheidung sowohl untereinander als auch vom umgebenden Gewebe erleichtert.
Bereiten Sie drei beschriftete 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor. Geben Sie 45 Milliliter 80%iges Ethanol in jedes Röhrchen. Lege drei Röhrchen auf Eis. Stellen Sie ein Röhrchen mit 45 Millilitern 95 % Ethanol und ein Röhrchen mit 100 % Ethanol auf Eis. Geben Sie anschließend 45 Milliliter Xylol bei Raumtemperatur in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Tauen
Sie einen PEN-Membranschieber kurz auf, indem Sie ihn gegen eine behandschuhte Hand legen, und waschen Sie ihn zweimal 30 Sekunden lang in jedem der Röhrchen mit 80 % Ethanol unter Rühren, um die Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur zu entfernen. Legen Sie dann die Folie auf ein Blatt Aluminiumfolie. 0,8 Milliliter 0,1 % Kresylviolett in 50 % Ethanol auf den Objektträger pipettieren und 30 Sekunden lang färben.
Waschen Sie den Objektträger in der dritten Tube mit 80 % Ethanol 30 Sekunden lang. Entwässern Sie den Objektträger, indem Sie ihn 30 Sekunden lang durch das Röhrchen mit 95 % Ethanol, das Röhrchen mit 100 % Ethanol für 30 Sekunden und schließlich das Röhrchen mit Xylol für 30 Sekunden führen. Legen Sie danach die Objektträger 5 Minuten lang auf einen Feinwaschwischer, damit das Xylol ablaufen und die Abschnitte trocknen können.