JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:32 Min. • July 8th, 2025
In einer heterogenen Tumorzellpopulation würde die Behandlung mit einem Krebsmedikament die meisten Zellen abtöten, aber arzneimittelresistente Zellen überleben, was zu einem therapeutischen Versagen führt.
Um den Anteil der arzneimittelresistenten Zellen zu bestimmen, wird eine heterogene Tumorzellpopulation in eine Multi-Well-Platte ausgesät. Inkubieren, um die Zelladhärenz zu erleichtern. Fügen Sie eine zunehmende Konzentration einer geeigneten Krebsmedikamentenlösung hinzu.
Die Wechselwirkung mit Wirkstoffmolekülen führt dazu, dass empfindliche Zellen absterben und sich anschließend von den Kulturplatten lösen. Im Gegensatz dazu überleben arzneimittelresistente Zellen und bleiben an der Platte haften.
Aspirieren Sie das verbrauchte Medium, um die abgelösten Zellen zu entfernen. Fügen Sie frisches, arzneimittelfreies Medium hinzu und inkubieren Sie die Platte unter physiologischen Bedingungen. Die arzneimittelresistenten Zellen vermehren sich und bilden Tumorkolonien. Geben Sie nun Kristallviolett-Färbelösung zu den Völkern und inkubieren Sie.
Kristallviolett, ein violett gefärbter, membrandurchlässiger, positiv geladener Farbstoff, dringt in die Zellen ein und bindet anionische Proteine und DNA, wodurch den Zellen eine violette Farbe verliehen wird.
Fügen Sie als Nächstes Ethanol hinzu, um den nicht umgesetzten Fleck zu lösen. Waschen Sie, um überschüssige Flecken zu entfernen, und trocknen Sie die Platte an der Luft.
Medikamentenresistente Kolonien erscheinen als violette Punkte. Zähle die Anzahl der farbigen Kolonien in jeder Vertiefung. Stellen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität in einem Diagramm dar, um den Anteil arzneimittelresistenter Krebszellen bei jeder Arzneimittelkonzentration zu bestimmen.
Bei diesem Verfahren werden 2000 Zellen mit 2 Millilitern Medium pro Vertiefung in die 6-Well-Platten eingefüllt. Nach 24 Stunden fügen Sie steigende Konzentrationen von Docetaxel sowohl für DU145- als auch für 22Rv1-Zelllinien hinzu. Geben Sie DMSO nur in eine Vertiefung als Kontrolle mit der gleichen Lautstärke, die für die höchste Docetaxel-Dosis verwendet wird.
Nach 72 Stunden aspirieren Sie das arzneimittelhaltige Medium und fügen Sie frisches Docetaxel-freies Medium hinzu. Inkubieren Sie die Platten ein bis zwei Wochen lang, bis die Kolonien unter dem Mikroskop sichtbar sind.
Um die Kolonien zu färben, waschen Sie sie vorsichtig mit 2 bis 3 Millilitern PBS und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang mit zwei bis drei Millilitern kristallvioletter Lösung in der Gewebekulturhaube oder einem Abzug. Entfernen Sie anschließend die Färbelösung und waschen Sie die Platten mit 2 bis 3 Millilitern Wasser. Entfernen Sie dann das Wasser und trocknen Sie die Platten an der Luft.
Machen Sie digitale Bilder der Platten für die Darstellung von Figuren. Analysieren Sie das Ergebnis, indem Sie die Vertiefungen visualisieren und die Völker mit Hilfe eines Markierungsstifts manuell zählen.