JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:37 Min. • July 8th, 2025
Drosophila-Larven sind spezialisierte Zellen, die sich in Form von diskreten Clustern an der basalen Oberfläche der lateralen Epidermis - der oberflächlichen Hautschicht - anheften. Diese Önozyten sind in erster Linie am Fettstoffwechsel beteiligt.
Während des Hungerns sammeln diese Ösozyten überschüssige Lipidtröpfchen an. Jedes Tröpfchen besteht aus einem hydrophoben Kern aus neutralen Lipiden wie Triglyceriden und Cholesterinestern, der von einer Phospholipid-Monoschicht umgeben ist.
Um die Lipidtröpfchen sichtbar zu machen, nehmen Sie einen präparierten Schnitt der Larvenepidermis von Drosophila mit anhaftenden Önozyten. Die Behandlung erfolgt mit einem Fixierungspuffer, der Paraformaldehyd enthält, um die zellulären Proteine wie Proteasen zu vernetzen und die strukturelle Integrität der Önozyten zu erhalten. Entfernen Sie den Fixierpuffer. Inkubieren Sie mit einem fluoreszierenden Farbstoff auf BODIPY-Basis im Dunkeln, um Photobleiche zu vermeiden.
Während der Inkubation diffundiert der unpolare Farbstoff über die Zellmembran der Önozyten und durchquert die Monoschicht, die die Lipidtröpfchen umgibt. Die Hydrophobie der Farbstoffmoleküle ermöglicht es, dass sie in den unpolaren Kern der Lipidtröpfchen gelangen, um die neutralen Lipide zu binden.
Montieren Sie die Probe auf einen Objektträger, wobei die Önozyten den mikroskopischen Objektträger berühren, um eine klare Visualisierung zu gewährleisten. Verschließen Sie die Probe mit einem Deckglas und betrachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Bei Anregung durch blaues Licht bei einer Wellenlänge von vier dreiundneunzig Nanometern emittiert der Farbstoff grüne Fluoreszenz bei fünfhundertdreiundzwanzig Nanometern. Grün fluoreszierende Flecken bestätigen das Vorhandensein von Lipidtröpfchen.
Für die Lipidtröpfchenfärbung inkubieren Sie die präparierte Epidermis in Fixierungspuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator, gefolgt von einer schnellen Resuspension in 1 Milliliter PBS. Waschen Sie dann die Proben mit drei 5-minütigen Wäschen in 1 Milliliter PBS pro Waschgang, um alle Reste des Fixiermittels zu entfernen.
Nach dem letzten Waschen werden die epidermalen Proben mit einer geeigneten lipophilen Sonde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubiert. Wickeln Sie die Probenröhrchen während der Inkubation in Folie ein, um das Gewebe vor Licht zu schützen, und waschen Sie die Proben dreimal in 1 Milliliter PBS für 10 Minuten pro Waschgang.
Um die Önozyten abzubilden, überführen Sie jede Epidermisprobe in 6 Mikroliter Eindeckmedium auf einem sauberen Objektträger. Passen Sie die Ausrichtung des Gewebes so an, dass die innere Oberfläche, die die Ösozyten enthält, den unteren Rand des Objektträgers berührt. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Epidermis und versiegeln Sie die Ränder mit klarem Nagellack. Wenn die Politur getrocknet ist, bilden Sie die Proben auf einem konfokalen Mikroskop bei einer 63-fachen Vergrößerung mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen ab.