JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:08 Min. • July 8th, 2025
Osteoklasten sind große, kuppelförmige, mehrkernige Zellen, die auf der Knochenoberfläche zu finden sind. Diese Zellen enthalten zahlreiche zytoplasmatische Granula, die reich an tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) sind - einem Metalloprotein-Enzym, das von der gekräuselten Grenze der Osteoklasten in das Knochengewebe abgesondert wird. Dieses Enzym verdaut die extrazelluläre Matrix und löst die Mineralkristalle auf, wodurch die Knochenresorption erleichtert wird.
Um TRAP-Granulate als zytochemische Marker von Osteoklasten nachzuweisen, nehmen Sie eine Kulturschale mit adhärenten Osteoklasten. Geben Sie TRAP Färbelösung in die Zellen. Diese Lösung umfasst das Substrat - ein phosphathaltiges Naphthholderivat und Weinsäure in einem Puffer, der mit einem Diazoniumsalz ergänzt ist.
Fügen Sie dieser Lösung Essigsäure hinzu, um den sauren pH-Wert aufrechtzuerhalten, der für die TRAP-Färbung erforderlich ist. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei physiologischer Temperatur, um eine optimale TRAP-Enzymaktivität zu erzielen.
Die Färbelösung gelangt in die Osteoklasten, wo die Weinsäure die hydrolysierende Aktivität von tartratempfindlichen sauren Phosphatasen in anderen Zellen hemmt.
Gleichzeitig hydrolysiert TRAP das zugegebene Substrat, um seine Phosphatgruppe zu entfernen. Das hydrolysierte Substrat koppelt mit einem Diazoniumsalz aus der Färbelösung zu einem kastanienbraunen, unlöslichen Farbstoffkomplex. Dieser Komplex fällt als Granulat an den Stellen enzymatischer Aktivität aus.
Bilden Sie die Zellen unter einem Mikroskop ab. Die Ablagerung von kastanienbraunen Farbstoffgranulaten im Zytoplasma bestätigt das Vorhandensein von TRAP-haltigen Osteoklasten in der Kultur.
In diesem Schritt aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Probe dreimal vorsichtig mit 1X PBS. Fixieren Sie anschließend die Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Fixierlösung für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.
Nach der Fixierung aspirieren Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit deionisiertem Wasser, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Saugen Sie dann das deionisierte Wasser an und geben Sie 100 Mikroliter TRAP-Beize in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
Stellen Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator und schirmen Sie sie vor Licht ab. Aspirieren Sie nach dem Färben den TRAP-Fleck und waschen Sie ihn dreimal vorsichtig mit entionisiertem Wasser. Anschließend bilden Sie die Osteoklasten in einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung ab.