Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykanen: Eine Färbemethode zur Visualisierung von sulfatierten Glykosaminoglykanen in Polyacrylamidgelen

Sulfatierte Glykosaminoglykane, GAGs, sind lange, negativ geladene, lineare Polysaccharide mit sich wiederholenden Disaccharid-Einheitsketten, die an unterschiedlichen Positionen sulfatiert sind und in unterschiedlichen Längen vorliegen.

Um isolierte sulfatierte GAGs von Interesse mit unterschiedlicher Kettenlänge in einem Polyacrylamidgel nach der Elektrophorese sichtbar zu machen, nehmen Sie das Gel vorsichtig aus seiner Kassette. Spülen Sie mit entionisiertem Wasser ab und entfernen Sie anhaftende Gelstücke, die die Fleckenbildung beeinträchtigen könnten.

Mit einer sauren Alcianblau-Lösung behandeln. Unter sauren Bedingungen interagiert Alcianblau, ein polyvalenter kationischer Farbstoff mit einem Kupferatom in der Mitte, spezifisch mit negativ geladenen sulfatierten GAGs über ionische Wechselwirkungen und bildet einen tiefblauen wasserunlöslichen Komplex.

Waschen Sie das Gel mit entionisiertem Wasser und Methanol und entfernen Sie alle Fleckenreste. Inkubieren Sie das Gel mit einer alkalischen Silbernitratlösung. Unter alkalischen Bedingungen bieten die Alcian-Blau-gebundenen sulfatierten GAGs Stellen für positiv geladene Silberionen, um zu binden und einen Komplex zu bilden.

Behandeln Sie das Gel in einer Entwicklungslösung, die Formaldehyd und Zitronensäure enthält. Zitronensäure senkt den lokalen pH-Wert für eine optimale Aktivität von Formaldehyd, wodurch die Silberionen in den sulfatierten GAG-Fragmenten zu unlöslichem metallischem Silber reduziert werden, wodurch das Alcian-Blue-Signal verstärkt wird.

Fügen Sie eine Stopplösung hinzu, um den pH-Wert zu senken und die Reduktion von Silberionen für minimale Hintergrundflecken zu verhindern. Stellen Sie sich nun das Gel vor.

Alcian Blau-Silber gefärbte sulfatierte GAG-Fragmentbanden erscheinen dunkelbraun oder schwarz, was eine hochempfindliche Visualisierung und Bestimmung der isolierten GAG-Polymerkettenlängen ermöglicht.

Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel vorsichtig in einen großen, sauberen Behälter, der mit entionisiertem, gefiltertem Wasser gefüllt ist. Entsorgen Sie dann das Wasser und färben Sie das Gel fünf Minuten lang in Alcianblau-Färbelösung. Entsorgen Sie den Alcian-Blau-Fleck und waschen Sie ihn schnell zwei- bis dreimal mit entionisiertem, gefiltertem Wasser, bis der größte Teil der Alcian-Blau-Färbelösung entfernt wurde.

Färben Sie das Gel in Silbernitrat-Färbelösung in einem frischen, sauberen Behälter für 30 Minuten. Waschen Sie dann zwei- bis dreimal für jeweils 30 Minuten in entionisiertem, gefiltertem Wasser, um die Silberfärbelösung vollständig zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie die Entwicklungslösung hinzu.

Beobachten Sie das Gel sorgfältig auf das Erscheinungsbild von Bändern. Abhängig von der Qualität des Färbemittels und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung zwischen wenigen Sekunden und mehreren Minuten dauern. Sobald die gewünschten Banden sichtbar sind, verwerfen Sie sofort die Entwicklungslösung und waschen Sie das Gel kurz mit der Stopplösung.