Masson Goldner Trichrome-Färbung: Eine Technik zur Visualisierung von Kollagen in Herzschnitten zum Nachweis von kardiovaskulärer Fibrose
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 4:14 Min. • July 8th, 2025
Stressaktivierte kardiale Fibroblasten lagern überschüssiges Kollagen in verletzten Regionen ab, ein Zustand, der als Fibrose bezeichnet wird und die Herzfunktion beeinträchtigt.
Um das Ausmaß der Fibrose zu visualisieren, werden zunächst in Paraffin eingebettete Herzblöcke geschnitten. Platzieren Sie die Abschnitte auf einer Folie. Erhitzen Sie den Objektträger, um das Paraffin zu schmelzen, damit die Abschnitte haften können.
Tauchen Sie den Objektträger in Xylol, um das Gewebe zu entparaffinisieren. Behandeln Sie die Abschnitte mit absteigendem Alkoholgehalt, um die Abschnitte zu rehydrieren und die anschließende Bindung von wässrigen Fleckenkomponenten zu unterstützen.
Inkubieren Sie die Schnitte in einem sauren Fixiermittel, das Proteine vernetzt und die Gewebestruktur stabilisiert. Mit Wasser abspülen, um Reste des Fixiermittels zu entfernen.
Tauchen Sie den Objektträger in Hämatoxylinlösung. Der kationische Farbstoff bindet die negativ geladene DNA und färbt den Zellkern blau. Mit Wasser abspülen, um überschüssige Flecken zu entfernen.
Inkubieren Sie den Objektträger in saurem Fuchsin-Ponceau, einem niedermolekularen anionischen Farbstoff, der mit positiv geladenen zytoplasmatischen Proteinen und Kollagen interagiert und sie rot färbt. Mit verdünnter Essigsäure behandeln, um überschüssige Flecken zu entfernen.
Tauchen Sie den Objektträger in Phosphomolybdsäure-Orange G-Lösung. Orange G, ein niedermolekularer Farbstoff, färbt die Erythrozyten orangerot. Phosphomolybdsäure, eine großmolekulare Säure, vertreibt niedermolekulare Farbstoffe aus Kollagen und macht es farblos.
Inkubieren Sie die Abschnitte in hellgrünem Farbstoff, dessen Moleküle Kollagenfasern binden und grün färben. Unter dem Mikroskop erscheinen die fibrotischen Regionen grün, was auf eine übermäßige Kollagenablagerung hinweist.
Bei diesem Verfahren werden fünf Mikrometer dicke Gewebeschnitte aus den Paraffinblöcken mit einem manuellen Mikrotom präpariert. Als nächstes färben Sie einen Objektträger von jedem Herzabschnitt für jede Ratte mit Masson-Goldner-Trichrom-Färbung. Für die Paraffinabschnitte schmelzen Sie das Gewebe bei 60 Grad Celsius in einem Ofen. Entparaffinieren Sie sie unter einem Abzug zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol.
Rehydrieren Sie sie dann jeweils drei Minuten lang in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und dann in destilliertem Wasser. Für die entparaffinisierten Schnitte und für die Kryoschnitte fixieren Sie sie über Nacht in Bouin-Lösung. Spülen Sie sie am nächsten Morgen 10 bis 15 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser aus. Spülen Sie dann erneut mit destilliertem Wasser ab.
Die Fixierung in Bouin ist der wichtigste Schritt, um eine prächtige Goldner-Färbung zu gewährleisten.
Inkubieren Sie sie drei Minuten lang in Mayers Hämatoxylin. Entfernen Sie nach 3 Minuten die Objektträger und lassen Sie sie fünf Minuten lang in destilliertem Wasser. Inkubieren Sie sie anschließend fünf Minuten lang in Ponceau-Säure Fuchsin, bevor Sie sie eine Minute lang mit 1% Essigsäure spülen.
Inkubieren Sie anschließend die Abschnitte eine Minute lang in Phosphomolybdsäure Orange G und spülen Sie sie dann eine Minute lang in 1%iger Essigsäure aus. 10 Minuten in hellgrünem Farbstoff inkubieren und dann eine Minute lang in 1% Essigsäure spülen. Zum Schluss dehydrieren Sie die Abschnitte nacheinander 30 Sekunden lang in 70 % Ethanol, 30 Sekunden lang 95 % Ethanol und fünf Minuten lang in 100 % Ethanol. Tragen Sie einen Tropfen harziges Eindeckmittel auf die Gewebeschnitte auf, bedecken Sie sie mit Deckgläsern und legen Sie sie zum Trocknen.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Visualisierung von Fibrosen im Herzgewebe beschrieben, wobei der Fokus speziell auf der übermäßigen Kollagenablagerung durch stressaktivierte kardiale Fibroblasten liegt. Das Verfahren umfasst mehrere Färbetechniken, um fibrotische Bereiche unter dem Mikroskop hervorzuheben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiobiologie
- histologische Techniken
- Bewertung der Fibrose
Hintergrund
- Fibrose beeinträchtigt die Herzfunktion, indem sie die normale Gewebsarchitektur stört.
- Kardiale Fibroblasten spielen eine entscheidende Rolle bei der Kollagenablagerung unter Stressbedingungen.
- Die Visualisierung von Fibrose ist entscheidend für das Verständnis der kardialen Pathologie.
- Färbetechniken werden verwendet, um zwischen verschiedenen Gewebebestandteilen zu unterscheiden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Beurteilung der Kollagenablagerung im Herzgewebe.
- Anwendung spezifischer Färbetechniken zur Visualisierung fibrotischer Bereiche.
- Verbesserung des Verständnisses der Rolle kardialer Fibroblasten bei der Fibrose.
Verwendete Methoden
- Einbettung von Paraffin-herzblocken in fünf Mikrometer dicke Schnitte.
- Entparaffinisierung der Schnitte mit Xylol und Rehydratisierung mit absteigenden Alkoholkonzentrationen.
- Färbung mit Hämalumin, saurem Fuchsin-Ponceau und Lichtgrün-Farbstoff.
- Mikroskopische Untersuchung zur Identifizierung fibrotischer Bereiche anhand der Färbung.
Hauptergebnisse
- Fibrotische Bereiche wurden erfolgreich als grün unter dem Mikroskop sichtbar gemacht.
- Das Färbungsverfahren hob die Kollagenablagerung wirksam hervor.
- Kollagenfasern wurden von anderen Gewebekomponenten unterschieden.
- Die Methode erwies sich als zuverlässig zur Beurteilung von Fibrosen in Herzgewebe.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Färbeprotokoll ist wirksam zur Visualisierung kardialer Fibrose.
- Diese Methode kann zur Untersuchung kardialer Pathologien im Zusammenhang mit Fibrose beitragen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Techniken aufbauen, um therapeutische Interventionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Visualisierung der Kollagenablagerung im Herzgewebe ermöglicht die mechanistische Absicherung von therapeutischen Hypothesen im Zusammenhang mit Fibrose. Dieser histologische Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er quantitative und reproduzierbare Messgrößen für die Umgestaltung der extrazellulären Matrix liefert. Er hilft bei der Auswahl präklinischer Modelle und der Priorisierung von Wirkstoffkandidaten in der kardiovaskulären Arzneimittelforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung des Target-Engagements antifibrotischer Wirkstoffe durch direkte Visualisierung der Kollagenablagerung im erkrankten Myokard.
- Operationaler Wert: Bietet eine standardisierte, qualitative Beurteilung der Fibroblastenaktivierung und der Matrixumgestaltung in Nagetier-Infarktmodellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gewebebasierte Messgrößen, die mit molekularen Wegen korrelieren, die die pathologische Kollagensynthese antreiben.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays zwischen verschiedenen Laboren durch definierte Färbeprotokolle und Schnittparameter.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Charakterisierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Aktivität von Fibroblasten mit funktionellen Fibroseergebnissen verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die langfristige Überwachung der Wirkung antifibrotischer Substanzen in präklinischen Wirksamkeitsstudien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, indem sie die histopathologische Bestätigung einer Zielmodulation in Modellen kardiovaskulärer Erkrankungen liefert.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung fibroblastengetriebener Signalwege durch direkte Gewebevisualisierung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitativen Analysen nahestehende Ergebnisse zum Vergleich von Substanzeffekten in Fibrosemodellen.
- Analytik: Ermöglicht eine halbquantitative Beurteilung des fibrotischen Bereichs anhand der Färbungsintensität und Verteilungsanalyse.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischer Kontinuität durch validierte Endpunkte der Fibrose.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Histologieplattform für das Screening von kardiovaskulären Fibroseindikationen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die Uneindeutigkeit der Fibrose-Phänotypisierung verringert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Protokolle für Fixierung, Färbung und Schnittführung.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem histopathologische Nachweise einer Target-Modulation bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antifibrotischen Kandidaten basierend auf Nachweisen der Target-Bindung.
Durchführungsüberlegungen
- Histologische Fachkenntnisse in Gewebeschnitttechnik und Interpretation von Färbungen.
- Zugang zu Mikrotomen, Färbelösungen und Hellfeldmikroskopie.
- Standardisierung der Fixierungsdauer und Färbezeiten über verschiedene Bediener hinweg.
- Überlegungen zur Anpassung bei nicht-rodenten oder humanen Gewebemodellen.
- Begrenzungen hinsichtlich quantitativer Genauigkeit im Vergleich zur digitalen Bildanalyse oder Hydroxyprolin-Assays.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Verbessertes Nagetiermodell der Myokardischämie und Reperfusionsverletzung
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Picrosirius-Rotpolarisationsfärbung: Eine Technik zum Nachweis von Fibrose in Herzgewebeschnitten mittels Hellfeldmikroskopie
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ultraschall-Bewertung der myokarddialen Mikrostruktur
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Visualisierung
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Vorteile der kardialen Resynchronisationstherapie in einem asynchronen Herzinsuffizienz Modell induziert durch linke Bundle Branch Ablation und schnellen Tempo
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026