Sudan IV Färbung: Ein Verfahren zur Färbung von lipidbeladenen atherosklerotischen Plaques im entnommenen Aortenbogen der Maus

Atherosklerose tritt aufgrund der Ansammlung von Lipoproteinen in der inneren Auskleidung der Arterien auf, was zu einer Ansammlung von Plaque, einer Verdickung und Verengung der Arterien und einer verminderten Durchblutung führt.

Plaques bestehen aus einer fibrösen Kappe mit glatten Muskelzellen und extrazellulärer Matrix, die einen Kern aus Lipoproteinen niedriger Dichte, LDLs - kugelförmige Partikel mit einem hydrophoben Kern aus Cholesterinestern und Triglyceriden, umgeben von einer Phospholipid-Außenschicht - zusammen mit Entzündungszellen umschließt.

Um lipidreiche atherosklerotische Plaques sichtbar zu machen, besorgen Sie sich einen frisch entnommenen Aortenbogen aus der Maus und übertragen Sie ihn auf eine für einen dunklen Hintergrund angepasste Plattform, um den Kontrast bei der großflächigen Bildgebung zu verbessern. Fügen Sie Puffer hinzu, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.

Entfernen Sie das perivaskuläre Fettgewebe, das den Aortenbogen umgibt, um falsche Hintergrundfärbungen zu vermeiden. Schneiden Sie die Aorta und ihre Äste in Längsrichtung durch das Lumen ein, um die innerste Oberfläche mit atherosklerotischen Plaqueablagerungen freizulegen.

Befestigen Sie den geöffneten Aortenbogen auf der Plattform und inkubieren Sie ihn in Ethanol. Ethanol verdrängt Wasser aus dem Gewebe, inaktiviert Proteine und bewahrt die Gewebearchitektur.

Mit Sudan IV-Fleck behandeln, der in organischen Lösungsmitteln gelöst ist. Innerhalb der Plaque bewegt sich Sudan IV, ein fettlöslicher Diazofarbstoff mit hoher Affinität zu Triglyceriden und Cholesterinestern von Lipoproteinen, aus der organischen Lösungsmittelphase und bindet an den hydrophoben Lipidkern der LDLs, wodurch stabile Komplexe gebildet werden. Waschen Sie überschüssige Flecken mit Ethanol ab.

Unter dem Stereomikroskop erscheinen die gefärbten lipidreichen atherosklerotischen Plaques orangerot, während die Nicht-Plaque-Bereiche blass erscheinen.

Um ein Nadelbett für die Gesichtsanalyse vorzubereiten, falten Sie ein Segment der Paraffinwachsfolie 8 Mal, um eine flache Oberfläche von 25 x 25 Millimetern zu erhalten, und wickeln Sie schwarzes elektrisches Isolierband um die Folie, um einen dunklen Hintergrund für die Aorta zu erhalten.

Platzieren Sie ein Etikett auf der Rückseite des Steckbetts und notieren Sie sich mit einem Bleistift die Mausidentifikationsnummer. Übertragen Sie den Aortenbogen auf das Stiftbett und geben Sie einen Tropfen PBS in das Gewebe. Reinigen Sie die Aorta mit einem Stereomikroskop vom restlichen periadventtiellen Fettgewebe und ziehen Sie mit einer Vannas-Schere und einer Dumont-Pinzette das gesamte umgebende Fettgewebe sanft ab, ohne die Aorta zu manipulieren oder zu beschädigen.

Führen Sie als Nächstes die Vannas-Schere in das Aortenlumen ein, um die Intimoberfläche freizulegen. Beginnen Sie mit dem Schneiden der äußeren Krümmung des aufsteigenden Bogens in distaler Richtung, indem Sie die Äste, einschließlich der Arteria brachiocephalis, aufschneiden und den dorsalen Teil der absteigenden Brustregion schonen.

Um die innere Oberfläche sichtbar zu machen, schneiden Sie die kleinere Krümmung auf und falten Sie die Aorta auf. Befestigen Sie den offenen Bogen mit einem Mikro-Castroviejo-Nadelhalter mit dem stumpfen Ende der winzigen Insektenstifte am Stiftbett, ohne die Probe zu dehnen, und biegen Sie die Stifte vorsichtig von der Probe weg, während das Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird. Lagern Sie dann den festgesteckten Bogen mit der Vorderseite nach unten in einer Petrischale mit PBS bei 4 Grad Celsius.

Für die Sudan IV-Färbung spülen Sie die Probe 5 Minuten lang in einer Petrischale mit 70 % Ethanol mit dem Bogen nach unten, bevor Sie die Probe für 7 Minuten in eine Schale mit Sudan IV-Arbeitslösung geben.

Spülen Sie die Probe am Ende der Inkubation mit zwei 3-minütigen Wäschen in 80 % Ethanol, um die normale Oberfläche zu entfärben, gefolgt von einer abschließenden Spülung in PBS, bevor Sie das Gewebe wieder in seine ursprüngliche Petrischale zurückführen. Nehmen Sie dann Mikroaufnahmen unter einem Stereomikroskop auf, das mit einer Digitalkamera mit 10-facher Vergrößerung verbunden ist, und erhalten Sie Bilder des in PBS getauchten Nadelbogens, wobei Sie kleine Metallgewichte verwenden, um das Stiftbett am Boden der Petrischale zu halten.