Kationenaustauschchromatographie: Eine Technik zur Isolierung von rekombinantem Zielprotein aus Insektenzelllysat basierend auf der Nettooberflächenladung

Die Kationenaustauschchromatographie erleichtert die Proteintrennung von Gemischen auf der Grundlage ihrer Netto-Oberflächenladung.

Für die Isolierung von Zielsignalwandlerproteinen aus Insektenzellproteinlysat erhalten Sie ein dialysiertes Zielproteinlysat, das andere kontaminierende Proteine enthält. Fügen Sie natriumchloridhaltigen Puffer hinzu, um die Lysatviskosität zu verringern und die Proteinlöslichkeit zu verbessern, wodurch ein Verstopfen der chromatographischen Säule während des Laufs verhindert wird.

Darüber hinaus erleichtert der Puffer des pH-Werts unterhalb des isoelektrischen Punktes (pI) des Zielproteins, bei dem das Protein keine Nettoladung hat, die Bindung von überschüssigen Wasserstoffionen an negative Carboxylatgruppen, wodurch das Zielprotein positiv geladen wird.

Die chromatographische Säule mit vernetzten Agarosekügelchen wird zusammengebaut, die an negativ geladene Gruppen gekoppelt sind. Fügen Sie Bindungspuffer hinzu, um die Säule auszugleichen und die Wechselwirkungen zwischen Säule und Protein zu maximieren. Laden Sie das verdünnte Lysat auf die äquilibrierte Säule.

Mehr positiv geladene Zielproteine interagieren und binden fest an die negativ geladenen Gruppen der Säule als weniger positiv geladene kontaminierende Proteine.

Waschen Sie die Säule mit Puffer, um ungebundene, negativ geladene kontaminierende Proteine zu entfernen. Anschließend passieren Sie den Elutionspuffer, während Sie seine Ionenstärke allmählich erhöhen.

Bei niedriger Ionenstärke besteht ein minimaler Wettbewerb zwischen den positiven Ionen und Proteinen um die negativen Gruppen in der Säule, wodurch schwach gebundene, weniger positiv geladene kontaminierende Proteine eluiert werden. Mit zunehmender Ionenstärke konkurrieren Salzionen jedoch mit fest gebundenen Zielsignalwandlerproteinen und reduzieren die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Säule, wodurch sie als gereinigte Fraktion eluiert werden.

Eine 20-Milliliter-Kationenaustauschsäule wird durch Waschen mit drei Säulenvolumina Puffer G und dann mit drei Säulenvolumina Puffer F hergestellt. Als nächstes verdünnen Sie 20 Milliliter der dialysierten Probe auf eine endgültige Natriumchloridkonzentration von 100 Millimolar, indem Sie 20 Milliliter Puffer E hinzufügen, und tragen Sie die Probe auf die Austauschsäule auf.

Es ist wichtig, die kleine Menge der Probe zu verdünnen, anstatt alle auf einmal, und die verdünnten Proben sollten sofort nach der Verdünnung auf die Säule aufgetragen werden, um die Ausfällung des Proteins zu begrenzen.

Fahren Sie mit der Beladung der Säule mit frisch verdünnter Probe fort, während sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Beladung nähert. Waschen Sie dann die Säule bis zur Ausgangsabsorption 280 mit Puffer F, was typischerweise drei Säulenvolumina erfordert.

Eluieren Sie das Protein aus der Säule mit einem 400-Milliliter-Gradienten von Puffer F zu 65 % Puffer G, wobei das Eluat in 6-Milliliter-Fraktionen gesammelt wird. Sobald der Gradient abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Waschen der Säule fort, um weitere 1,5 Säulenvolumina mit 65 % Puffer G zu erhalten.