JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 4:15 Min. • July 8th, 2025
Sulfatierte Glykosaminoglykane wie Heparansulfate, HSs, sind negativ geladene, lineare, sulfatierte Polysaccharide mit variabler Kettenlänge, die an Proteine der Zelloberfläche gebunden sind.
Um unterschiedlich lange HSs, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden, abzuschätzen, beginnen Sie mit der Assemblierung der Gelkassette. Füllen Sie es teilweise mit hochkonzentrierter Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung, einschließlich Katalysatoren - Ammoniumpersulfat und Tetramethyl-ethylen-diamin. Mit Wasser überziehen, um Luftkontakt zu verhindern, der die Polymerisation hemmen kann. Ausbrüten.
Katalysatoren induzieren die Acrylamid-Bisacrylamid-Polymerisation und bilden ein kleinporiges auflösendes Gel. Wasser wegwerfen. Geben Sie eine geringe Konzentration an Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung mit Katalysatoren zu. Führen Sie einen Gelkamm ein, um Vertiefungen zu erzeugen. Die Lösung polymerisiert und bildet ein großporiges Stapelgel.
Beladen Sie die Kammern des Elektrophoresetanks mit Laufpuffer, um eine optimale elektrische Leitfähigkeit während der Elektrophorese zu gewährleisten.
Das HS-Gemisch wird in einem Ladepuffer gelöst, der Tracking-Farbstoff und Saccharose enthält. Übertragen Sie anschließend diese Mischung und Standard-HS-Leitern in Kassettenvertiefungen. Saccharose beschränkt das Gemisch auf die Vertiefungen. Farbstoff hilft, das Fortschreiten der Elektrophorese zu überwachen.
Elektrophorese bei niedriger Spannung einleiten. Negativ geladene HSs durchlaufen das Stapelgel in Richtung der positiv geladenen Anode und konzentrieren sich aufgrund des Porengrößenunterschieds an der Grenzfläche zwischen stapelbar und auflösendem Gel.
Erhöhen Sie die Spannung. Kleinkettige HSs wandern schnell durch das auflösende Gel und durchlaufen weiter, während langkettige HSs in der Gelmatrix gefangen bleiben und sich langsam bewegen.
Färben Sie das Gel nach der Elektrophorese. HSs erscheinen als unterschiedliche Banden, wobei kleinkettige HSs niedriger positioniert sind als langkettige HSs. Die Länge einzelner HSs kann durch einen Vergleich mit HS-Standards bestimmt werden.
Legen Sie zunächst eine leere Kassette in den PAGE-Tank ein. Gießen Sie das Lösungsgel, indem Sie 10 Milliliter Lösungsgellösung mit 60 Mikrolitern frisch zubereitetem 10%igem Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter TEMED hinzu. Drehen Sie das Rohr vorsichtig 2 bis 3 Mal um.
Geben Sie mit einer Pipette schnell 10 Milliliter der aktivierten Polyacrylamid-Gellösung in die Kassette. Mit 2 Millilitern entionisiertem gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 Minuten lang polymerisieren lassen.
Nachdem das auflösende Gel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser. Gießen Sie das Stapelgel, indem Sie 3 Milliliter Stapelgellösung mit 90 Mikrolitern frisch zubereitetem 10%igem Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen. Fügen Sie dann 3 Mikroliter TEMED hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 2 bis 3 Mal um.
Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das verfestigte Auflösungsgel zu geben, bis die Kassette bis zum Rand gefüllt ist. Führen Sie den Kamm, der mit der leeren Polyacrylamid-Gelkassette geliefert wurde, vollständig ein und lassen Sie das Stapelgel 30 Minuten lang polymerisieren. Sobald das Gel polymerisiert ist, entfernen Sie den Klebebandstreifen von der Unterseite der Kassette und setzen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe ein. Füllen Sie die obere und untere Kammer mit den jeweiligen Pufferlösungen.
Getrocknete Glykosaminoglykanproben werden in dem minimal erforderlichen Volumen an deionisiertem, gefiltertem Wasser aufgelöst und mit dem Probenbeladungspuffer im Verhältnis 1:1 gemischt. Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharidleitern in das Gel.
Lassen Sie das Gel 5 Minuten lang bei 100 Volt erneut laufen. Lassen Sie es dann 20 bis 100 Minuten lang bei 200 Volt laufen, abhängig vom Acrylamidanteil der auflösenden Gellösung.