Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

Beginnen Sie mit der Behandlung der Proteinprobe mit einem denaturierenden Puffer, der aus einem Detergens - Natriumdodecylsulfat, SDS - und einem Reduktionsmittel - Beta-Mercaptoethanol - besteht. Kurz erhitzen. Während dieses Schritts unterbricht Beta-Mercaptoethanol die Disulfidbindungen und sorgt für eine entfaltete Konformation des Proteins.

Die entfalteten Proteine mit ihren exponierten hydrophoben Aminosäuren binden an das negativ geladene SDS und erhalten eine gleichmäßige negative Ladung. Fügen Sie der Probe einen geeigneten Tracking-Farbstoff hinzu, um sie in Echtzeit zu visualisieren.

Laden Sie nun die Probe und den Marker für die Standardmolekülgröße in separate Vertiefungen, die im Stapelgel vorhanden sind - die oberste Schicht des Polyacrylamidgels enthält eine geringere Konzentration an vernetzten Acrylamidpolymeren.

Schließen Sie das mit Puffer gefüllte Gelgerät an die Stromversorgung an.

In Gegenwart eines elektrischen Feldes wandern negativ geladene Proteine frei zur Anode und stapeln sich zusammen, um in das auflösende Gel einzudringen - die untere Schicht enthält ein Gel mit höherer Konzentration.

Im auflösenden Gel beginnen die Proteine entsprechend ihrer Molekülgröße zu wandern, wobei kleinere Proteine schnell wandern, was zu optimal aufgelösten Proteinbanden führt. Stoppen Sie danach den Lauf und entfernen Sie das Gel.

Färben Sie das Gel mit einem anionischen Farbstoff, Coomassie blue, der elektrostatisch an die basischen Aminosäuren in Proteinen bindet und ihnen eine blaue Färbung verleiht. Entfärben Sie das Gel anschließend zur besseren Visualisierung in Essigsäurelösung.

Entfernen Sie das Gel und identifizieren Sie die getrennten Proteine anhand ihres geschätzten Molekulargewichts.

Bereiten Sie zwei Trenngele vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Gießen Sie das Gel mit einer 1-Milliliter-Pipette zwischen die Glasplatten und achten Sie darauf, dass die oberen 2 Zentimeter frei von der Mischung sind. Geben Sie 70 % Ethanol auf das Trenngel, wodurch eine gleichmäßige Grenzfläche zwischen den beiden Schichten entsteht.

Sobald die Trenngele polymerisiert sind, bereiten Sie die Stapelgele gemäß den Anweisungen im Textmanuskript vor. Entfernen Sie dann das Ethanol aus den Trenngelen und fügen Sie die Stapelgellösung hinzu. Führen Sie vorsichtig einen Kamm mit der gewünschten Anzahl von Taschen ein, ohne Luftblasen einzuführen, und lassen Sie das Gel 20 bis 30 Minuten lang polymerisieren.

Laden Sie 4 Mikroliter jeder Probe sowie die Proteinleiter in separate Vertiefungen. Lassen Sie das Gel dann 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in Tris-Glycin-Laufpuffer bei 144 Volt laufen. Verwenden Sie vorgewärmte Fairbanks-Lösung A, um die Gele 30 Minuten lang auf einer Wippe zu färben, und vorgewärmte Fairbanks-Lösung D, um die Gele auf einer Wippe zu entfärben, bis der gewünschte Hintergrund erreicht ist.