Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die RNA-Analyse: Eine Technik zur Trennung von fluoreszenzmarkierten phosphorylierten RNA-Oligonukleotiden von ihren nicht-phosphorylierten Äquivalenten

Entnehmen Sie zunächst eine Probe, die fluoreszenzmarkierte phosphorylierte und nicht-phosphorylierte RNA-Oligonukleotide enthält, die mit dem Beladungsfarbstoff gemischt sind, der Harnstoff enthält. Erhitzen Sie die Probe.

Harnstoff - ein starkes Vergällungsmittel - in Kombination mit der Hitze denaturiert die sekundäre RNA-Struktur, was zu ihrer linearisierten und unstrukturierten Konformation führt. Gießen Sie nun das Gel, indem Sie die Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung mit Harnstoff mischen.

Fügen Sie Tetramethylendiamin, einen Katalysator, und Ammoniumpersulfat, ein Oxidationsmittel, hinzu, um die anschließende Gelpolymerisation zu erleichtern.

Gießen Sie die Lösung in eine vormontierte Kassette. Führen Sie einen Kamm ein, um Vertiefungen für die Probenbeladung zu erstellen. Lassen Sie das Gel polymerisieren. Setzen Sie die Kassette in das Gelgerät ein. Fügen Sie dem oberen und unteren Reservoir einen laufenden Puffer hinzu und halten Sie den Stromfluss durch das gesamte Gel aufrecht. Den Kamm entfernen.

Laden Sie die mit Visualisierungsfarbstoff vermischte Probe in die Vertiefung und schließen Sie das Gel an eine Stromversorgung mit der gewünschten Spannung an. Der Harnstoff im Gel ermöglicht es RNA-Molekülen, als lineare Spezies zu wandern.

Das Gel wirkt wie ein Sieb, das es den negativ geladenen RNA-Molekülen ermöglicht, sich durch die Poren in Richtung der positiven Elektrode zu bewegen. Während des Laufs bewegt sich die phosphorylierte RNA, die von Natur aus negativer ist, schneller als nicht-phosphorylierte RNA.

Stellen Sie das Gel für den Nachweis von fluoreszenzmarkierter RNA dar. Beobachten Sie die Mobilitätsverschiebung zwischen der schneller migrierenden phosphorylierten RNA, die im Vergleich zur unphosphorylierten RNA als untere Bande erscheint.

Um eine 15%ige denaturierende Acrylamid-Gellösung herzustellen, mischen Sie 22,5 Milliliter vorgemischte 40%ige Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung, 6 Milliliter 10X FSME, 28,8 Gramm Harnstoff und RNasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 59 Millilitern. Rühren Sie dann die Lösung vorsichtig um.

Erhitzen Sie die Lösung 20 Sekunden lang in der Mikrowelle, rühren Sie sie um und stellen Sie sie sofort für weitere 20 Sekunden in die Mikrowelle. Rühren Sie die Lösung vorsichtig um, bis sich der Harnstoff vollständig aufgelöst hat. Legen Sie das Glasbecherglas 5 Minuten lang in ein flaches Wasserbad mit kaltem Wasser und stellen Sie sicher, dass der Gehalt an kaltem Wasser, der das Glasbecherglas umgibt, über dem Niveau der Lösung im Glasbecher liegt. Wenn die Lösung abgekühlt ist, filtern und entgasen Sie sie mit einer 0,22-Mikrometer-Einwegfiltrationseinheit, um Partikel und mikroskopisch kleine Luftblasen zu entfernen.

Waschen Sie eine kurze und eine lange Glasplatte mit Wasser und Seife. Besprühen Sie dann jede Platte mit 95 % Ethanol und wischen Sie das Glas ab, um Feuchtigkeit zu entfernen. Hebe die lange Platte von der Tischplatte ab, indem du sie auf eine Kiste legst. Positionieren Sie dann 0,4-Millimeter-Abstandshalter entlang der langen Kanten der Platte. Legen Sie die kurze Platte auf die lange Platte, und achten Sie darauf, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind. Klemmen Sie dann jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklammern fest.

Geben Sie 24 Mikroliter TEMED in die Acrylamidlösung und mischen Sie sie. Fügen Sie dann 600 Mikroliter 10% APS hinzu und gießen Sie die Lösung sofort zwischen die Glasplatten.

Das Gießen der Acrylamidlösung zwischen das Glasplattensandwich kann eine echte Herausforderung sein. Um Luftblasen zu vermeiden, klopfen Sie auf das Glasplattensandwich, während Sie Ihre Lösung eingießen.

Legen Sie vorsichtig einen sauberen 32-Well-Kamm auf die Oberseite des Glasplattensandwichs und lassen Sie das Acrylamid 30 Minuten lang polymerisieren.

Um das Gel laufen zu lassen, stellen Sie den Heizblock auf 75 Grad Celsius ein, entfernen Sie die Metallklammern und waschen und trocknen Sie das Glasplattensandwich gründlich. Positionieren Sie das Plattensandwich mit der kurzen Platte nach vorne in der Gelapparatur und bereiten Sie einen 0,5-fachen TBE-Laufpuffer vor, indem Sie 100 Milliliter 10-faches TBE mit 1,9 Litern RNase-freiem Wasser kombinieren.

Geben Sie 600 Milliliter des laufenden Puffers in die obere und untere Kammer des Geräts. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm aus dem Gel und spülen Sie die Vertiefungen gründlich mit einer Spritze aus. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 50 Watt vorlaufen. Spülen Sie dann die Vertiefungen erneut aus.

Pulsdrehen Sie die abgeschreckten Reaktionen und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang bei 75 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Pulsdrehung und laden Sie sofort 10 Mikroliter jeder Probe auf das Gel. Lassen Sie das Gel dann 3 Stunden lang bei 50 Watt laufen. Wenn der Lauf beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Geräts.

Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplattensandwiches. Decken Sie es dann mit Folie ab und übertragen Sie es zur Bildgebung auf einen Laserscanner. Montieren Sie das Glasplattensandwich auf den Tisch des Laserscanners, stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen für das gewünschte Fluorophor ein und bilden Sie das Gel ab.