Multimer-PAGE zur Trennung nativer Proteinkomplexe: eine hybride Trenntechnik bestehend aus blauem native-PAGE und SDS-PAGE zur Trennung intakter multimerer Proteine aus Gewebelysat

Multimere Proteinkomplexe sind essentiell für verschiedene biologische Prozesse.

Um Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand durch Multimer-PAGE zu trennen, wird Gewebelysat entnehmen, das die gewünschten Komplexe enthält. Laden Sie das Lysat auf eine Gel-Assemblierung für die native Blue-PAGE.

Füllen Sie das System mit einem alkalischen Laufpuffer mit blauem anionischem Farbstoff und schließen Sie ihn an die Stromversorgung an. Bei einem alkalischen pH-Wert binden Farbstoffmoleküle an den Proteinkomplex und verleihen ihm eine insgesamt negative Ladung, ohne zu denaturieren. Dieser negativ geladene, intakte Proteinkomplex wandert als blaue Bande durch das Gel.

Nach einem minimalen Lauf und dem Einweichen des intakten Proteins in das auflösende Gel wird der Streifen, der den Komplex enthält, herausgeschnitten. Inkubieren Sie den Streifen in einer Lösung, die ein Vernetzungsmittel enthält, damit seine reaktiven Gruppen mit den Amingruppen des proximalen Proteins interagieren und den multimeren Komplex stabilisieren können.

Ersetzen Sie die Vernetzungslösung durch ein Quenching-Reagenz, um die Aktivität der nicht umgesetzten Vernetzer zu verringern. Fügen Sie SDS hinzu - ein anionisches Detergens -, das dem intakten Proteinkomplex eine gleichmäßige negative Ladung verleiht, während seine native Größe und Zusammensetzung erhalten bleiben.

Legen Sie den behandelten Streifen in eine frische Kassette und gießen Sie ihn erneut in ein neues SDS-PAGE-Gel. Bei der Elektrophorese wandert der negativ geladene vernetzte Proteinkomplex in Richtung der positiven Anode und erscheint als hochmolekulare Bande im Gel.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie sich auf die Elektrophorese des blauen nativen Polyacrylamid-Gels vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Schließen Sie die Elektroden an die Stromversorgung an und elektrophoresieren Sie die Proteine im Gel bei 150 Volt, bis die Farbstoffbande etwa 2 Zentimeter in die Auflösungsschicht vordringt. Stoppen Sie an dieser Stelle die Stromversorgung und trennen Sie sie.

Trennen Sie nach der Demontage des Elektrophoresegeräts die Glasscheiben der Gelkassette. Entfernen und entsorgen Sie die Stapelschicht.

Schneide das Gel vorsichtig knapp unterhalb der unteren Kante der Färbefront ab und achte darauf, dass dieser Schnitt so glatt und gerade wie möglich ist. Entsorgen Sie dann das unbenutzte Stück Gel. Schneiden Sie alle unbenutzten Teile entlang der Ränder des Gelstreifens ab.

Legen Sie den Streifen vorsichtig in 10 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in einen kleinen Behälter und mischen Sie ihn vorsichtig durch Nutation für 30 Minuten, um ihn auszugleichen. Nach der Äquilibrierung das PBS verwerfen und durch weitere 10 Milliliter ersetzen.

Pipettieren Sie 500 Mikroliter 25 Millimolar DSP, gelöst in Dimethylsulfoxid, in das PBS und mischen Sie 30 Minuten lang wie zuvor weiter. Gießen Sie nach 30 Minuten die DSP-Lösung ab. Fügen Sie 10 Milliliter 0,375 molare Tris-HCl, pH 8,8, mit 2% Natriumdodecylsulfat hinzu, um das nicht umgesetzte DSP zu löschen. Setzen Sie die Nutation für 15 Minuten fort.

Während der Gelstreifen abschreckt, bereiten Sie SDS-PAGE-Gellösungen nach Standardmethoden vor. Fügen Sie die Polymerisationsreagenzien nicht hinzu. Nach dem Abschrecken wird der blaue native Gelstreifen wieder auf Raumtemperatur gebracht und in eine neue Gelkassette gegossen.

Nehmen Sie dazu das Gel vorsichtig auf und legen Sie es auf eine saubere Gelkassetten-Abstandsplatte. Richten Sie den Streifen so aus, dass er von seiner vorherigen Ausrichtung umgedreht wird und die Unterseite der Farbfront der Oberseite der neuen Kassette am nächsten ist.

Platzieren Sie den Streifen so, dass seine Oberkante auf einer Höhe der Oberkante der Abdeckplatte liegt. Achte darauf, dass die Vorderseite des Farbstoffs parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte verläuft. Schieben Sie eine Seite des herausgeschnittenen Streifens gegen eine der Abstandshalterwände, so dass auf der anderen Seite Platz für das Gel zum Gießen und zum Laden eines Proteinstandards oder einer Leiter bleibt. Wenn die Unterkante des Gelstreifens gezackte oder unebene Stellen enthält, schneiden Sie diese vorsichtig ab.

Sobald der Gelstreifen richtig positioniert ist, legen Sie die Abdeckplatte über die Distanzplatte. Üben Sie sanften Druck aus, um eingeschlossene Luftblasen herauszudrücken. Fahren Sie mit dem Zusammenbau des Gel-Pouring-Geräts gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.

Der Gelstreifen verschiebt sich manchmal, wenn die obere Platte platziert wird. Es hilft, den Streifen ein wenig über den Rand der oberen Platte hängen zu lassen, damit er mit einem Spatel angepasst werden kann, um eventuelle Verschiebungen zu korrigieren.

Geben Sie Polymerisationsreagenzien zu dem auflösenden Gelpuffer und gießen Sie es mit einer serologischen Pipette in die vorbereitete Gelkassette. Füllen Sie die Gelkassette bis etwa 2 Zentimeter unter den ausgeschnittenen blauen nativen PAGE-Gelstreifen, um Platz für die Stapelschicht zu lassen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Butanol über das gegossene Gel hinzu und lassen Sie 30 Minuten für die Polymerisation der auflösenden Schicht warten, bevor Sie das Butanol abgießen.

Geben Sie anschließend die Polymerisationsreagenzien in die Stapelgellösung. Gießen Sie die Stapelschicht mit einer serologischen Pipette ein, um alle verbleibenden leeren Räume in der Gelkassette zu füllen. Kippen Sie die Gelkassette, während die Stapelschicht gegossen wird, so dass sie den Raum unter dem Gelstreifen ausfüllt und keine Luftblasen eingeschlossen werden.

Während der Stapelgelpuffer den leeren Raum unter dem Gelstreifen ausfüllt, bringen Sie die Gelkassette nach und nach wieder auf einen ebenen Boden. Füllen Sie den leeren Raum neben dem herausgeschnittenen Gelstreifen weiter mit dem Stapelgelpuffer, bis er fast überläuft. Lassen Sie dann die Stapelschicht 30 Minuten lang polymerisieren.

Nachdem die Stapelschicht polymerisiert ist, nehmen Sie die Gelkassette aus der Gießvorrichtung, spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab und bauen Sie die Elektrophoresevorrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammen.

Füllen Sie die innere Kammer vollständig mit 1X SDS-PAGE Laufpuffer. Füllen Sie dann die äußere Kammer bis zu dem vom Hersteller angegebenen Füllstand. Beladen Sie den Raum neben dem exzidierten Gelstreifen mit einer Molekulargewichtsleiter oder dem entsprechenden Proteinstandard.

Schließen Sie die Elektroden an das Netzteil an und elektrophoresieren Sie die Proben bei 120 Volt. Wenn der Coomassie-Farbstoff aus dem Gel läuft, stoppen Sie den Lauf und trennen Sie die Stromversorgung. Analysieren Sie das Gel mit Standardmethoden des Elektroblottings und des Antikörper-basierten Proteinnachweises.