JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:29 Min. • July 8th, 2025
Um die Größe von DNA-Fragmenten mittels Kapillarelektrophorese zu bestimmen, beginnen Sie mit der Entnahme einer Multi-Well-Assay-Platte. Jede Vertiefung enthält fluoreszenzmarkierte, unterschiedlich große PCR-Amplikons - doppelsträngige DNA-Oligonukleotide, die nach einem PCR-Zyklus gewonnen werden.
Geben Sie ein paar unterschiedlich große, doppelsträngige DNA-Fragmente in die Vertiefung, die als Größenstandard dienen. Jedes dieser DNA-Moleküle trägt zur einfachen Identifizierung eine Fluoreszenzmarkierung.
Ergänzen Sie die Mulde mit Formamid, einem starken Vergällungsmittel, und erhitzen Sie sie bei hoher Temperatur. Dieser Schritt denaturiert die DNA und bildet einzelsträngige Fragmente, die leicht durch die Gelporen wandern können.
Legen Sie die Platte in eine Fragmentanalysatoreinheit, die vorinjiziertes Polymergel in ihrem Kapillarsystem enthält.
Legen Sie eine hohe Spannung an, um die DNA aus dem Well elektrokinetisch in die Kapillare mit dünnem Durchmesser an der Kathode - dem negativen Terminus - einzuführen. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern auf die positiv geladene Anode zu. Die kürzeren DNA-Stränge sind weniger Reibungskräften ausgesetzt und bewegen sich schneller durch das Gel als die längeren DNA-Stränge.
Bei der Elektromigration kreuzt die DNA den Weg des Laserstrahls, wodurch der Farbstoff fluoresziert. Die Emissionssignale des Farbstoffs werden von einem Detektor erfasst und später in ein Elektropherogramm übersetzt - ein Diagramm, das jede fluoreszierende DNA als unterschiedlich gefärbten, individuellen Peak darstellt.
Vergleichen Sie den Peak des unbekannten DNA-Fragments mit den Referenzpeaks, um seine Größe zu analysieren.
Verwenden Sie nach Bestätigung der PCR-Amplikons neue PCR-Streifen oder -Platten, um die PCR-Produkte 1 bis 10 in gereinigtem Wasser zu verdünnen. Vortexen und kurz zentrifugieren. Während Sie in einem Abzug arbeiten, bereiten Sie in einem Zentrifugenröhrchen einen Mastermix vor, der aus Formamid und Standardlösung in Referenzgröße besteht.
Entsprechend der Anzahl der zu analysierenden PCR-Produkte sind Reagenzienvolumina zu verwenden, wie im Manuskript beschrieben. Erlauben Sie ein Überschussvolumen von 10 %.
Kurz vortexen und 9,5 Mikroliter in einzelne Wells auf einer PCR-Platte verteilen, passend für das zur Verfügung stehende Kapillarelektrophorese-System. Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter verdünntes PCR-Produkt hinzu. Verschließen und kurz zentrifugieren.
Laden Sie dann die Platte mit den Proben in einen PCR-Thermocycler und denaturieren Sie die Proben 3 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, bevor Sie sie auf unbestimmte Zeit auf 4 Grad Celsius abkühlen. 1 Minute lang bei 1.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig die Dichtung und laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes Kapillarelektrophoresesystem.
Führen Sie die Kapillarelektrophorese der Fragmentanalyse mit Reagenzien durch, die für das Gerät Ihrer Wahl geeignet sind, und passen Sie die Laufbedingungen gemäß der Beschreibung im Manuskript an.