Kapillarelektrophorese: Eine Technik zur Analyse von fluoreszenzmarkierten Polymerase-Kettenreaktionsamplikons

Um die Größe von DNA-Fragmenten mittels Kapillarelektrophorese zu bestimmen, beginnen Sie mit der Entnahme einer Multi-Well-Assay-Platte. Jede Vertiefung enthält fluoreszenzmarkierte, unterschiedlich große PCR-Amplikons - doppelsträngige DNA-Oligonukleotide, die nach einem PCR-Zyklus gewonnen werden.

Geben Sie ein paar unterschiedlich große, doppelsträngige DNA-Fragmente in die Vertiefung, die als Größenstandard dienen. Jedes dieser DNA-Moleküle trägt zur einfachen Identifizierung eine Fluoreszenzmarkierung.

Ergänzen Sie die Mulde mit Formamid, einem starken Vergällungsmittel, und erhitzen Sie sie bei hoher Temperatur. Dieser Schritt denaturiert die DNA und bildet einzelsträngige Fragmente, die leicht durch die Gelporen wandern können.

Legen Sie die Platte in eine Fragmentanalysatoreinheit, die vorinjiziertes Polymergel in ihrem Kapillarsystem enthält.

Legen Sie eine hohe Spannung an, um die DNA aus dem Well elektrokinetisch in die Kapillare mit dünnem Durchmesser an der Kathode - dem negativen Terminus - einzuführen. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern auf die positiv geladene Anode zu. Die kürzeren DNA-Stränge sind weniger Reibungskräften ausgesetzt und bewegen sich schnel