Basische Einzelzell-Gelelektrophorese: eine empfindliche Technik zur quantitativen Abschätzung von DNA-Schäden in einzelnen Krebszellen nach Chemotherapie

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Biologische Techniken

0 Ansichten • 5:06 Min. • July 8th, 2025

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Chemotherapeutika induzieren einzel- und doppelsträngige DNA-Brüche in Krebszellen, was zu DNA-Schäden und Zelltod führt.

Um DNA-Schäden zu quantifizieren, mischen Sie die mit Chemotherapie behandelten Krebszellen mit geschmolzener, niedrigschmelzender Agarose. Pipettieren Sie diese Mischung auf agarosevorbeschichtete Objektträger. Lassen Sie die geschmolzene Agarose verfestigen und betten Sie die Zellen in die poröse Gelmatrix ein.

Mit einem Lysepuffer behandeln, der hohe Konzentrationen an Reinigungsmitteln und Salzen enthält. Detergenzien lösen Zell- und Kernmembranen auf. Darüber hinaus entfernt das hohe Salzgehalt die Histonproteine von der DNA, so dass supergewickelte DNA an die Kernmatrix gebunden bleibt.

In alkalischem Elektrophoresepuffer inkubieren. Das alkalische Milieu führt dazu, dass sich DNA-Supercoils abwickeln und Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA-Brüche freilegen.

Legen Sie die Objektträger in eine Elektrophoresepuffer-haltige Gelschale. Elektrophorese einleiten.

Da die DNA negativ geladen ist, wird sie von der positiven Anode angezogen. Die beschädigten DNA-Fragmente wandern aus dem Zellkern heraus und wandern durch die poröse Gelmatrix, wobei sich längere Fragmente langsamer bewegen als kürzere Fragmente. Im Gegenteil, unbeschädigte DNA wandert nicht ohne weiteres und bleibt im Zellkern.

Färben Sie die Zellen nach der Elektrophorese mit fluoreszierender Nukleinsäure-Farbstofflösung. Die Farbstoffmoleküle binden an die DNA.

Unter dem Fluoreszenzmikroskop weisen einzelne Zellen, die beschädigte DNA enthalten, eine fluoreszierende Kometenstruktur auf. Der Kometenkopf repräsentiert die unbeschädigte DNA, während der "Schweif" aus beschädigten DNA-Fragmenten besteht.

Die Länge und Intensität des Kometenschweifs gibt Aufschluss über das Ausmaß der DNA-Schäden in einzelnen mit Chemotherapie behandelten Krebszellen.

Kombinieren Sie die Zellsuspension mit 1 % geschmolzener Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einem Volumenverhältnis von 1:10. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren und sofort 30 Mikroliter auf einen Objektträger pipettieren. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze, um das Agarose-Zell-Gemisch zu verteilen, um die Bildung einer dünnen Schicht zu gewährleisten. Legen Sie die Objektträger flach bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten in die Dunkelheit. Tauchen Sie die Objektträger eine Stunde lang bis über Nacht in 4 Grad Celsius heiße Lyselösung im Dunkeln.

Für den alkalischen Kometen-Assay entfernen Sie die Objektträger vorsichtig aus der Lyselösung, lassen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und tauchen Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius im Dunkeln vorsichtig in AES, damit sich die DNA abwickeln kann.

Geben Sie vorgekühltes AES in die Elektrophorese-Objektträgerschale. Überschreiten Sie nicht 0,5 Zentimeter über den Rutschen. Legen Sie die Objektträger hinein und decken Sie sie mit einer Kappe ab. Stellen Sie die Netzspannung auf 1 Volt pro Zentimeter ein und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius laufen. Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, lassen Sie überschüssiges AES von den Objektträgern ab.

Tauchen Sie die Objektträger zweimal vorsichtig in destilliertes Wasser bei Raumtemperatur, jeweils fünf Minuten lang. Tauchen Sie die Objektträger danach vorsichtig fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol ein.

Beginnen Sie mit dem Färbevorgang, indem Sie die Objektträger 10 bis 15 Minuten lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius trocknen. Geben Sie anschließend 50 bis 100 Mikroliter grün fluoreszierende Nukleinsäure-Färbelösung auf die getrocknete Agarose jedes Objektträgers und färben Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Spülen Sie die Objektträger kurz in destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie vollständig bei 37 Grad Celsius im Dunkeln.

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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026