Mikrofluidische Kapillarelektrophorese zur Fragmentgrößenbestimmung von PCR-Produkten: Eine mikrochipbasierte elektrophoretische Trenntechnik zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe

Die mikrofluidische Elektrophorese ist eine Technik zur Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe innerhalb von Mikrokapillaren.

Nehmen Sie zunächst einen mikrofluidischen Multi-Well-Chip mit ausgewiesenen Vertiefungen für die Mischung aus gelbasiertem Polymer und Fluoreszenzfarbstoff, DNA-Proben und einer bekannten DNA-Leiter mit bekanntem Molekulargewicht. Diese Vertiefungen sind über ein Netzwerk von Mikrokanälen miteinander verbunden.

Geben Sie die Gel-Farbstoff-Mischung in die zugewiesenen Vertiefungen. Montieren Sie den Chip auf einer Zündstation, die mit einer leeren Spritze vormontiert ist. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten und üben Sie Druck aus, um das Gel-Farbstoff-Gemisch in den Trennmikrokanal zu drücken.

Entfernen Sie den Chip und pipettieren Sie andere Komponenten in die entsprechenden Vertiefungen. Fügen Sie den Vertiefungen, die die Leiter und die Proben enthalten, einen Marker hinzu - einen internen Standard, der die Probengröße kalibriert.

Setzen Sie den Mikrochip in einen Fragmentanalysator ein, um den Chip auszuführen. Im Inneren erzeugt die angelegte Spannung elektrophoretische Kräfte, die die Probe aus der Vertiefung in den Mikrokanal für die Probenbeladung treiben, von wo aus sie den Kreuzschnittpunkt zwischen diesem Kanal und dem Trennkanal erreicht. Der elektrische Strom hilft der Probe, in den Trennmikrokanal einzudringen.

Die fluoreszierenden Farbstoffmoleküle interkalieren negativ geladene DNA-Fragmente, die sich mit unterschiedlichen elektrophoretischen Geschwindigkeiten im Verhältnis zu ihrer Molekülgröße auf die Anode zubewegen - kleinere Fragmente wandern schneller als größere. Folglich trennen sich die Fragmente in unterschiedlich große Banden, die fluoreszieren.

Ein laserbasierter Detektor misst die Fluoreszenz jeder Bande und zeichnet sie als Elektropherogramm auf, das unterschiedlich große DNA als deutlichen Peak anzeigt.

Bringen Sie vor dem Start das DNA-Farbstoffkonzentrat, die DNA-Gelmatrix, den DNA-Marker, die DNA-Leiter und die gereinigten DNA-Proben auf Raumtemperatur. Richten Sie die Ansaugstation ein, indem Sie die Spritze austauschen und die Grundplatte anpassen. Lassen Sie dann den Hebel des Spritzenclips los und schieben Sie ihn in die obere Position.

Starten Sie die Leimungssoftware und bereiten Sie die Gel-Farbstoff-Mischung vor. Reiben Sie das Farbstoffkonzentrat 10 Sekunden lang und schleudern Sie es nach unten. Geben Sie dann 25 Mikroliter des Farbstoffs in ein Gelmatrix-Fläschchen und vermischen Sie die Lösung.

Übertragen Sie die Gel-Farbstoff-Mischung in einen Schleuderfilter. Legen Sie es in die Zentrifuge und drehen Sie es 10 Minuten lang mit 1.500 mal g. Wenn Sie bereit sind, die Gel-Farbstoff-Mischung zu laden, setzen Sie einen neuen DNA-Chip in die Priming-Station ein und geben Sie 9 Mikroliter der Gel-Farbstoff-Mischung in die Vertiefung, die mit "G" gekennzeichnet ist.

Schließen Sie die Ansaugstation und stellen Sie sicher, dass sich der Kolben an der 1-Milliliter-Markierung befindet. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er vom Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 Sekunden und lassen Sie dann den Clip los. Warten Sie weitere 5 Sekunden und ziehen Sie dann den Kolben langsam in die 1-Milliliter-Position zurück.

Öffnen Sie die Priming-Station und geben Sie 9 Mikroliter Gel-Farbstoff-Mischung in die mit "G" gekennzeichneten Vertiefungen. Geben Sie 5 Mikroliter Marker in die mit einem Leitersymbol gekennzeichnete Vertiefung und jede der 12 Probenvertiefungen.

Geben Sie 1 Mikroliter der Leiter in die Vertiefung mit dem Leitersymbol und 1 Mikroliter des PCR-Produkts oder Wasser in die Probenvertiefungen. Drehen Sie den Chip 1 Minute lang auf 2.400 U/min. Setzen Sie ihn in den Bioanalysator ein und lassen Sie den Chip innerhalb von fünf Minuten laufen.