Nicht-reduzierendes SDS PAGE: Eine Methode zur Analyse von Disulfid-verknüpften multimeren Proteinkomplexen

Multimere Proteine werden durch intermolekulare, kovalente Disulfidbindungen zwischen ihren Cysteinresten stabilisiert, was für die Aufrechterhaltung ihrer strukturellen und funktionellen Integrität entscheidend ist.

Um solche Komplexe durch nicht-reduzierende PAGE zu analysieren, nehmen Sie die gewünschte Konzentration von Disulfid-stabilisierten Proteinen. Fügen Sie einen nicht reduzierenden Probenpuffer hinzu und erhitzen Sie die Probe.

Dieser Puffer enthält SDS, das den Proteinen eine insgesamt negative Ladung verleiht, und einen Tracking-Farbstoff, um ihre Bewegung im Gel sichtbar zu machen. Dem Puffer fehlt jegliches Reduktionsmittel, wodurch die Disulfidbindungen unbeeinträchtigt bleiben und der multimere Komplex intakt bleibt.

Laden Sie die einzelnen Komplexe in Vertiefungen des Polyacrylamid-Gels mit dem gewünschten Prozentsatz, die in einer Gelvorrichtung vormontiert sind. Geben Sie eine Proteinleiter bekannter Größe in eine andere Vertiefung. Tauchen Sie die Vertiefungen in einen SDS-basierten Laufpuffer und schließen Sie das Gerät an eine Stromversorgung an.

Der elektrische Strom zwingt die negativ geladenen Proteinkomplexe, sich durch die Poren des Gels in Richtung Ano