Isoelektrische Fokussierung in der Flüssigphase: Eine Elektrophoresetechnik zur Trennung bioaktiver Moleküle aus rohem Gymnema sylvestre-Extrakt

Beginnen Sie mit einer vormontierten isoelektrischen Fokussierung, IEF-Zelle - einer Flüssigphasenelektrophoreseeinheit. Bei dieser Säule handelt es sich um eine unterteilte, horizontale poröse Kammer mit unterschiedlichen Plus- und Minuspolen an den Enden.

Nehmen wir nun den Pflanzenextrakt, der eine komplexe Mischung aus unterschiedlich geladenen Komponenten mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten, pI enthält - ein pH-Wert, bei dem die Nettoladung eines Moleküls Null ist.

Der Extrakt wird mit Ampholyten variabler Ladung ergänzt, die die spätere Fraktionierung der Probenbestandteile erleichtern.

Laden Sie die Probe in die Ladeöffnungen der Säule. Derzeit hat die IEF-Säule einen konstanten pH-Wert. Legen Sie anschließend eine Hochspannung an, um die Elektrophorese zu starten.

Unter dem elektrischen Feld wandern die löslichen Ampholyten zu entgegengesetzt geladenen Elektroden und bilden einen linearen pH-Gradienten über die Säule. Die Probenkomponenten beginnen durch den pH-Gradienten der Flüssigphase zu wandern, und diejenigen, die bei einem pH-Wert unterhalb ihres pI positioniert sind, tragen eine positive Nettoladung.

Diese wandern in Richtung der negativen Elektrode, bis die Komponenten ihren pI erreichen, wo sich ihre Ladung neutralisiert und die Migration stoppt. In ähnlicher Weise wandern Komponenten mit einem pH-Wert über ihrem pI zur positiven Elektrode und stoppen, wenn sie ihren pI erreichen. Dabei werden die Probenkomponenten anhand ihres pI in fokussierte Kompartimente unterteilt. Ernten Sie die gereinigten Fraktionen für die weitere Analyse.

Fügen Sie 0,6 Gramm Gymnema sylvestre-Pflanzenextrakt zu 60 Millilitern destilliertem Wasser hinzu. Lösen Sie den Pflanzenextrakt auf, indem Sie ihn fünf Minuten lang in einem Rollrohr mischen.

Um die unlöslichen Partikel zu entfernen, zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 x g für fünf Minuten. Den Überstand in ein 150-Milliliter-Glasbecherglas geben und Ampholyt hinzufügen, um eine 1%ige Lösung zu erhalten, etwa 0,6 Milliliter.

Laden Sie die Lösung mit einer 50-Milliliter-Spritze und einer 1,5-Zoll-Nadel mit stumpfem Ende und 19 Gauge durch die Probenentnahmeöffnungen in die IEF-Zelle. Nehmen Sie dann die Zelle vom Ständer und klopfen Sie auf die Elektrodenkammer, um Blasen zu entfernen und zu entfernen.

Schließen Sie das Gerät an das Kühlwasser an. Beginnen Sie mit einer konstanten Leistung von 15 Watt mit der Fraktionierung. Lassen Sie das IEF-Gerät laufen, bis die Spannung einen konstanten Wert erreicht, d. h. etwa drei Stunden.

Nachdem Sie die Taste Harvest ON gedrückt haben, richten Sie die Fraktionssammlerstifte an den Sammelanschlüssen aus. Schieben Sie die Stifte durch das Dichtungsband, um mit dem Sammeln der Gymnema sylvestre-Fraktionen zu beginnen.