Die Anwendung des dauerhaften mittleren Hirnarterie Ligation in der Maus
25. Juli 2011
A. cerebri media (MCA) Ligation ist eine Technik, fokaler zerebraler Ischämie im Tiermodell zu studieren. Bei dieser Methode ist die mittlere Hirnarterie durch Kraniotomie freigelegt und ligiert durch Kauterisation. Diese Methode liefert gut reproduzierbare Infarktvolumen und erhöhte postoperative Überlebensrate im Vergleich zu anderen Methoden zur Verfügung.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die fokale zerebrale Ischämie in Tiermodellen zu untersuchen. Dazu wird zunächst ein kleiner Hautschnitt zwischen dem linken Auge und der Ohrbasis angelegt. Anschließend erfolgt eine Kraniotomie an der Verbindung von Jochbogen und Schuppenbein, um die Arteria cerebri media freizulegen; diese wird dann mit einem kleinen Gefäßkoagulator ligiert.
Schließlich wird die Haut genäht, um die Wunde zu schließen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen Infarkt im linken Hemisphäre des Maushirns zeigen. Das Gehirn kann mit TTC gefärbt oder mittels MRT untersucht werden, um einen Schlaganfall sichtbar zu machen.
Das geschädigte Gehirn kann auch zur Bestimmung der Protein- oder mRNA-Expression verwendet werden. Hallo, ich bin Garza Chola. Ich bin Doktorandin im Labor von Gale Johnson an der University of Rochester.
Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Schlaganfallbereich beantworten, beispielsweise durch die Aufklärung der Mechanismen, die zur Zellsterblichkeit im ischämischen Gehirn führen. Zur Vorbereitung der Operation sämtliche chirurgischen Instrumente, Gazetupfer und Applikatoren durch Autoklavierung sterilisieren. Die chirurgischen Werkzeuge während der Operation in 70 %igem Ethanol aufbewahren und unmittelbar vor Gebrauch auf steriler Gaze lufttrocknen lassen.
Sprühen Sie den Arbeitsbereich zwei Stunden vor der Operation mit 70 % Ethanol ein. Injizieren Sie die Maus mit 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin. Das Medikament wird unmittelbar nach der Operation erneut verabreicht und anschließend alle drei bis fünf Stunden während der ersten 24-stündigen postoperativen Phase.
Verwenden Sie einen Anästhesieverdampfer, um die Maus mit einer Mischung aus 3 % ISO-Fluoran und 20 % Sauerstoffgas zu anästhesieren. Stellen Sie die Sauerstoffmenge mit einem Durchflussmesser ein. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe durch Zupinnen von Zehen oder Schwanz.
Die Anästhesietiefe mit 2 % ISO-Fluoran aufrechterhalten. Künstliche Tränen auf die Augen der Maus auftragen und Vorsicht walten lassen, um die Augen nicht zu beschädigen. Während des chirurgischen Eingriffs.
Legen Sie die Maus mithilfe der Tierhaarschere in Seitenlage auf die rechte Seite. Rasieren Sie den Bereich auf der linken Seite zwischen dem linken Auge und der Basis des linken Ohres ab. Reinigen Sie den Bereich abwechselnd mit einer Betadine-Lösung und 70 %igem Ethanol unter Verwendung von Wattestäbchen, indem Sie die Stelle leicht abreiben.
Wiederholung ist erforderlich. Platziere die Maus auf einer Heizplatte, die mit einem rektalen Probesensor verbunden ist. Um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten, führe den rektalen Probesensor unter Verwendung von Mineralöl ein. Positioniere die Maus unter dem Mikroskop auf der rechten Seite und fixiere sie mit Klebeband.
Schneiden Sie ein Fenster in einen Gazetupfer und bedecken Sie den Operationsbereich mit feinen geraden Scheren. Führen Sie einen vertikalen Schnitt zwischen dem linken Auge und der Basis des linken Ohres durch. Verwenden Sie gebogene Hämostaten, um den Operationsbereich offen zu halten, falls eine übermäßige Austrocknung des Gewebes während der Operation auftritt.
Verwenden Sie Wattestäbchen, um sterile PBS aufzutragen. Verwenden Sie eine Feder-Schere, um einen horizontalen Schnitt in den Schläfenmuskel zu machen, und ziehen Sie langsam mit einer Pinzette, um den Schläfenmuskel leicht vom Schädel zu lösen. Halten Sie den Kieferknochen mit einer gebogenen Pinzette fest und verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um eine kleine subtemporale Kraniotomie an der Verbindung von Jochbogen und Schuppenbein zu erstellen.
Bei der Schädelöffnung entfernen die Chirurgen kleine Teile des Schädels, um die A. cerebri media (MCA) freizulegen. Der Processus zygomaticus und der Orbitainhalt dürfen dabei nicht beschädigt werden. Mit einem kleinen Gefäßverödungsinstrument wird der distale Abschnitt der MCA abligiert, der Musculus temporalis wird in seine ursprüngliche Position zurückverlagert und mit Nylon-Nähten der Stärke 5-0 verschlossen.
Um die Schnittstelle zu schließen, beenden Sie die Anästhesie und entfernen Sie die rektale Sonde. Injizieren Sie der Maus eine zweite Dosis Buprenorphin subkutan. Bringen Sie die Maus in den Käfig zurück, der bei 37 Grad Celsius gehalten wurde.
Mit einer Heizplatte. Überwachen Sie die Maus in den nächsten 24 Stunden genau auf Anzeichen von Unwohlsein, einschließlich vermindertem Appetit oder Wasseraufnahme, hängender Körperhaltung, erhöhter Atmung oder gesträubtem Fell. Verabreichen Sie der Maus unmittelbar nach der Operation ein Erholungsgel.
Warten Sie zwei bis drei Stunden nach der Operation. Danach injizieren Sie der Maus alle drei bis fünf Stunden über einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden subkutan Buprenorphin. 24 Stunden nach der Operation betäuben Sie die Maus tief und perfundieren sie mit 4 % TTC.
Entfernen Sie das Gehirn und geben Sie es für eine Nacht in eine 4 %ige Paraformaldehydlösung. Am nächsten Tag positionieren Sie das Gehirn in den Schneideblock. Schneiden Sie das Gehirn mit Rasierklingen in eintausend Mikrometer dicke Schnitte.
Platzieren Sie die Schnitte neben einem Millimeterskala-Lineal. Fotografieren Sie die Schnitte mit einer an ein Stereomikroskop angeschlossenen Digitalkamera in der Bild-J-Software.
Klicken Sie auf das Dateimenü und öffnen Sie das gewünschte Foto. Klicken Sie auf den Reiter „gerade Linie“ im Programm. Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen den beiden Markierungen am Lineal.
Klicken Sie auf das Menü „Analysieren“ und wählen Sie „Skala festlegen“. Geben Sie die bekannte Distanz als eins an und die Längeneinheit als Millimeter. Klicken Sie auf die Registerkarte „Freihand-Kreis“.
Zeichnen Sie einen Kreis, um die kontralaterale Hemisphäre abzugrenzen. Klicken Sie auf das Menü „Analysieren“ und wählen Sie „Messen“. Das Berechnungsfenster öffnet sich und zeigt die Fläche des gezeichneten Kreises an.
Zeichnen Sie einen weiteren Kreis um die kontralaterale Hemisphäre, wobei der Bereich mit der weißen Markierung ausgeschlossen wird. Messen Sie die Fläche wie zuvor gezeigt. Der neue Wert wird dem Berechnungsfenster hinzugefügt.
Die Differenz zwischen dem ersten und zweiten Wert stellt die Infarktfläche dar. Berechnen Sie die Schlaganflächengröße in jeder Schicht, indem Sie die oben genannten Schritte für Schichtdicken von einem Millimeter wiederholen. Berechnen Sie das Schlaganfallvolumen, indem Sie die in jeder Schicht ermittelten Schlaganflächen addieren.
Diese Abbildung zeigt das TTC-gefärbte Gehirn 24 Stunden nach permanenter MCA-Ligation bei einer Wildtyp-C57BL/6-Maus. Der Schlaganfallherd erscheint weiß und ist in verschiedenen Vergrößerungen und Ansichten sichtbar. Dargestellt sind hier eintausend Mikrometer dicke Schnitte des TTC-gefärbten Schlaganfallgehirns vom vorderen bis zum hinteren Infarktgebiet.
Das Volumen wurde 24 Stunden nach der Operation berechnet. Das Volumen des Infarkts beträgt ungefähr 23 Kubikmillimeter Einmal Senf. Diese Technik kann in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.
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Übersicht
Die Ligaturtechnik der Arteria cerebri media (A. cerebri media) wird verwendet, um fokale zerebrale Ischämie in tierexperimentellen Modellen zu untersuchen. Bei dieser Methode wird die Arteria cerebri media freigelegt und ligiert, was zu reproduzierbaren Infarktvolumina und verbesserten Überlebensraten nach der Operation führt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Schlaganfallforschung
- Tiermodelle
Hintergrund
- Fokale zerebrale Ischämie ist ein zentraler Forschungsbereich zum Verständnis des Schlaganfalls.
- Die MCA-Ligationsmethode ermöglicht kontrollierte Experimente.
- Tiermodelle liefern Erkenntnisse über die Mechanismen des menschlichen Schlaganfalls.
- Verbesserte Überlebensraten erhöhen die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen einer fokalen zerebralen Ischämie.
- Beurteilung der Infarctvolumina unter kontrollierten Bedingungen.
- Verbesserung des Verständnisses der Schlaganfallpathologie.
Verwendete Methoden
- Ein Schnitt zwischen dem linken Auge und der Basis des Ohres wird durchgeführt.
- Am Jochbogen und am Schuppenbein wird eine Kraniotomie durchgeführt.
- Die Arteria cerebri media wird mit einem kleinen Gefäßverödungsinstrument ligiert.
- Die Haut wird vernäht, um die Wunde nach dem Eingriff zu schließen.
Hauptergebnisse
- Infarkt lokalisiert in der linken Hemisphäre des Maushirns.
- Sichtbarmachung des Schlags durch TTC-Färbung oder MRT.
- Die Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der MCA-Ligatur-Technik.
- Hohe Reproduzierbarkeit der Infarktvolumina festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Die MCA-Ligation ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung fokaler zerebraler Ischämie.
- Erhöhte Überlebensraten tragen zur Validität der Befunde bei.
- Diese Technik kann zur weiteren Erforschung von Schlaganfalltherapien eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Modell der permanenten Mittelhirnarterien-Ligatur bietet ein reproduzierbares System zur Untersuchung fokaler zerebraler Ischämie und ermöglicht die mechanistische Absicherung neuroprotektiver Substanzen in der präklinischen Schlaganforschung. Durch die Erzeugung konsistenter Infarktvolumina bei Mäusen unterstützt diese Methode die Target-Validierung und Assay-Entwicklung für therapeutische Kandidaten, die ungedeckte medizinische Bedürfnisse beim ischämischen Schlaganfall adressieren. Ihre Relevanz für die menschliche Pathologie – bei rund 80 % der Schlaganfälle treten diese im Bereich der A. cerebri media auf – erhöht das Vertrauen in die Übertragbarkeit der Ergebnisse und die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten in der frühen Entdeckungsphase.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in ischämischen Signalwegen durch gezielte Induktion einer fokalen Ischämie.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die Beteiligung von Zielstrukturen an der Bildung des Infarktkerns und des Penumbra-Raums geklärt wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine reproduzierbare Quantifizierung des Infarkts mittels TTC-Färbung und damit eine konsistente Beurteilung der Zielstrukturenbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die Wirkstoff-Screening vor, indem ein krankheitsrelevantes Ischämie-Modell etabliert wird.
- Operativer Wert: Standardisiert die Infarkt-Messung mittels TTC-basierter Volumetrie und ermöglicht so eine quantitative Dosis-Wirkungs-Analyse.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays durch Überlebensraten von ~80 %, wodurch die Variabilität pharmakologischer Endpunkte verringert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die humane Schlaganfallpathologie mit hoher anatomischer und pathophysiologischer Relevanz für Infarkte im MCA-Gebiet.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung intrazellulärer Hypoxie-Antwortmechanismen in vivo und unterstützt die Entdeckung von Biomarkern.
- Operativer Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch standardisierte chirurgische und Färbeprotokolle.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung und bietet eine Plattform für die mechanistische Risikominderung von Schlaganfalltherapeutika.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung neuroprotektiver Zielstrukturen, indem kontrollierte ischämische Schädigungen und die Quantifizierung von Infarkten ermöglicht werden.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays durch standardisierte TTC-Färbung sicher und liefert quantitative Infarktvolumina zur Bewertung von Substanzen.
- Analytik: Erzeugt volumetrische Messungen (z. B. ca. 23 mm³ Infarkt nach 24 h), die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen und die Bestimmung der Effektgröße ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, da die Lokalisation der Infarkte menschlichen Schlaganfallmustern entspricht, was die risikoadjustierte Weiterentwicklung unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung mehrerer Substanzen in verschiedenen Projekten, dank ihrer Reproduzierbarkeit und standardisierter Endpunkte.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in ischämischen Signalwegen reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Verfahren für Kraniotomie, Ligatur und TTC-Färbung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung und Abbruch von Projekten, indem zuverlässige Infarktdaten bereitgestellt werden, wodurch biologische Risiken in späteren Phasen von Schlaganfallprogrammen verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung neuroprotektiver Kandidaten basierend auf konsistenten präklinischen Wirksamkeitssignalen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mikrochirurgie an Nagetieren und der neuroanatomischen Identifizierung der A. cerebri media.
- Benötigt mikrochirurgische Instrumente wie Gefäßkoagulatoren, Heizplatten und präzise Nähtechniken.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise im Team bezüglich Anästhesie, Analgesie und postoperativer Überwachungsprotokolle.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung der Techniken von Ratten- auf Mausmodelle, einschließlich der Nahtgröße und der Präzision der Okklusion.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit terminaler Endpunkte zur Quantifizierung des Infarkts mittels TTC-Färbung oder MRT.
