Die Anwendung des dauerhaften mittleren Hirnarterie Ligation in der Maus
25. Juli 2011
A. cerebri media (MCA) Ligation ist eine Technik, fokaler zerebraler Ischämie im Tiermodell zu studieren. Bei dieser Methode ist die mittlere Hirnarterie durch Kraniotomie freigelegt und ligiert durch Kauterisation. Diese Methode liefert gut reproduzierbare Infarktvolumen und erhöhte postoperative Überlebensrate im Vergleich zu anderen Methoden zur Verfügung.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die fokale zerebrale Ischämie in Tiermodellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein kleiner Schnitt in der Haut zwischen dem linken Auge und der Basis des Ohrs gemacht wird. Als nächstes wird eine Kraniotomie an der Verbindung zwischen dem Jochbogen und dem Schuppenbein durchgeführt, um die mittlere Hirnarterie freizulegen, die mittlere Hirnarterie wird dann mit einem Kleingefäß-Kauterizer ligiert.
Zum Schluss wird die Haut vernäht, um die Wunde zu verschließen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen Infarkt zeigen, der sich auf der linken Hemisphäre des Mausgehirns befindet. Das Gehirn kann mit TTC gefärbt oder mittels MRT gescannt werden, um einen Schlaganfall sichtbar zu machen.
Das Schlaganfallgehirn kann auch zur Bestimmung der Protein- oder mRNA-Expression verwendet werden. Hallo, ich bin Garza Chola. Ich bin Doktorand im Labor von Gale Johnson an der University of Rochester.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Schlaganfallbereich zu beantworten, wie z.B. die Veranschaulichung der Mechanismen, die zu Zellen im ischämischen Gehirn führen. Um sich auf die Operation vorzubereiten, sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, Mullschwämme und kognitiven Applikatoren im Autoklaven. Bewahren Sie chirurgische Instrumente während der Operation in 70%igem Ethanol auf und trocknen Sie sie direkt vor dem Gebrauch auf steriler Gaze an der Luft.
Sprühen Sie den Arbeitsbereich zwei Stunden vor der Operation mit 70% Ethanol ein. Injizieren Sie der Maus 0,05 Milligramm Buprenorphin pro Kilogramm. Das Medikament wird unmittelbar nach der Operation erneut verabreicht und dann alle drei bis fünf Stunden während der ersten 24 Stunden nach der Operation.
Verwenden Sie einen Anästhesieverdampfer, um die Maus mit einem Gemisch aus 3 % ISO Fluor und 20 % Sauerstoff zu betäuben. Stellen Sie die Sauerstoffmenge mit einem Durchflussmesser ein. Testen Sie den Grad der Anästhesie durch Einklemmen der Zehen oder des Schwanzes.
Halten Sie das Anästhesieniveau mit 2% ISO-Fluor aufrecht. Tragen Sie künstliche Tränen auf die Augen der Maus auf und seien Sie vorsichtig, um das Auge nicht zu schädigen. Während des chirurgischen Eingriffs.
Platzieren Sie die Maus mit der Tierschere auf der rechten Seite in einer seitlichen Position. Rasieren Sie den Bereich auf der linken Seite zwischen dem linken Auge und der Basis des linken Ohrs. Reinigen Sie den Bereich, indem Sie mit Wattestäbchenapplikatoren zwischen einer Betadine-Lösung und 70%igem Ethanol wechseln und den Bereich leicht reiben.
Eine Wiederholung ist notwendig. Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, das mit einer Rektalsonde verbunden ist. Um die Körpertemperatur auf 37 Grad Celsius zu halten, führen Sie die Rektumsonde mit Mineralöl ein. Positionieren Sie die Maus auf der rechten Seite unter dem Mikroskop und befestigen Sie sie mit Klebeband.
Schneiden Sie ein Fenster in einen Mullschwamm und decken Sie den Operationsbereich mit einer feinen geraden Schere ab. Machen Sie einen vertikalen Schnitt zwischen dem linken Auge und der Basis des linken Ohrs. Verwenden Sie gebogene Hämostatika, um den Operationsbereich offen zu halten, wenn es während der Operation zu einer übermäßigen Austrocknung des Gewebes kommt.
Verwenden Sie Wattestäbchen-Applikatoren, um steriles PBS aufzutragen. Machen Sie mit einer Federschere einen horizontalen Schnitt in den Schläfenmuskel und ziehen Sie langsam mit einer Pinzette, um den Schläfenmuskel leicht vom Schädel zu trennen. Halten Sie den Kieferknochen mit einer gekrümmten Pinzette fest und verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um eine kleine subtemporale Kraniotomie an der Verbindung zwischen dem Jochbogen und dem gedrungenen Sohlenknochen durchzuführen.
Beim Bone Run entfernen die Geschworenen kleine Schädelstücke, um die MCA freizulegen. Der Jochbogen und der Orbitainhalt sollten dabei nicht beschädigt werden. Mit einem kleinen Gefäßkauterizer wird der distale Teil des MCA ligiert, der Schläfenmuskel wieder in seine ursprüngliche Position gebracht und fünf Nylon-Nähte ohne Null verwendet.
Um die Inzisionsstelle zu schließen, brechen Sie die Anästhesie ab und entfernen Sie die Rektumsonde. Injizieren Sie der Maus eine zweite Dosis Buprenorphin subkutan. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein, der bei 37 Grad Celsius gehalten wurde.
Mit einem Heizpaneel. Überwachen Sie die Maus in den nächsten 24 Stunden genau auf Beschwerden, einschließlich abnehmendem Appetit oder Wasserverbrauch, gebeugter Haltung, erhöhter Atmung oder aufgerichtetem Haar. Geben Sie der Maus unmittelbar nach der Operation ein Erholungsgel.
Warten Sie zwei bis drei Stunden nach der Operation. Dann injizieren Sie der Maus bis zu 24 Stunden alle drei bis fünf Stunden subkutan Buprenorphin. 24 Stunden nach der Operation die Maus tief anästhesieren und die Maus mit 4% TTC durchbluten.
Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es über Nacht in eine 4%ige Paraform-Aldehydlösung. Positionieren Sie das Gehirn am nächsten Tag in den Schnittblock. Schneide das Gehirn mit Rasierklingen in ein Millimeter dicke Scheiben.
Platzieren Sie die Scheiben neben einem Lineal im Millimetermaßstab. Verwendung einer Digitalkamera, die an ein Präpariermikroskop angeschlossen ist. Fotografieren Sie die Schichten im Bild J Software.
Klicken Sie auf das Dateimenü und öffnen Sie das gewünschte Foto. Klicken Sie im Programm auf die Registerkarte Geradlinigkeit. Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen den beiden Rändern auf dem Lineal.
Klicken Sie auf das Menü "Analysieren" und wählen Sie "Skala festlegen". Legen Sie den bekannten Abstand auf eins und die Längeneinheit auf Millimeter fest. Klicken Sie auf die Registerkarte Freihandkreis.
Zeichne einen Kreis, um die kontralaterale Hemisphäre zu umreißen. Klicken Sie auf das Menü "Analysieren" und wählen Sie "Messen". Es öffnet sich das Berechnungsfenster, in dem die Fläche des gezeichneten Kreises angezeigt wird.
Zeichnen Sie einen weiteren Kreis um die ipsilaterale Hemisphäre, wobei Sie den weißen Strichbereich ausschließen. Messen Sie die Fläche wie zuvor gezeigt. Der neue Wert wird dem Berechnungsfenster hinzugefügt.
Die Differenz zwischen dem ersten und dem zweiten Wert stellt die Fläche des Infarkts dar. Berechnen Sie die Strichfläche in jeder Schnitte, indem Sie die obigen Schritte für eine Schichtdicke von einem Millimeter wiederholen. Berechnen Sie das Hubvolumen, indem Sie die in jedem Segment berechnete Hubfläche summieren.
Diese Abbildung zeigt das TTC-Färbegehirn 24 Stunden nach der permanenten MCA-Ligation in einer Wildtyp-C 57 BL Sechs-Maus. Die Schlaganfallstelle sieht weiß aus und kann aus verschiedenen Vergrößerungen und Winkeln gesehen werden. Hier sind ein Millimeter dicke Scheiben des TTC-gefärbten Schlaganfallhirns vom vorderen zum hinteren Infarkt
zu sehen.Das Volumen wurde 24 Stunden nach der Operation berechnet. Das Volumen des Infarkts beträgt etwa 23 Kubikmillimeter Einmal Senf. Diese Technik kann in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Danke fürs Zuschauen.
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Übersicht
Die Ligaturtechnik der Arteria cerebri media (A. cerebri media) wird verwendet, um fokale zerebrale Ischämie in tierexperimentellen Modellen zu untersuchen. Bei dieser Methode wird die Arteria cerebri media freigelegt und ligiert, was zu reproduzierbaren Infarktvolumina und verbesserten Überlebensraten nach der Operation führt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Schlaganfallforschung
- Tiermodelle
Hintergrund
- Fokale zerebrale Ischämie ist ein zentraler Forschungsbereich zum Verständnis des Schlaganfalls.
- Die MCA-Ligationsmethode ermöglicht kontrollierte Experimente.
- Tiermodelle liefern Erkenntnisse über die Mechanismen des menschlichen Schlaganfalls.
- Verbesserte Überlebensraten erhöhen die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen einer fokalen zerebralen Ischämie.
- Beurteilung der Infarctvolumina unter kontrollierten Bedingungen.
- Verbesserung des Verständnisses der Schlaganfallpathologie.
Verwendete Methoden
- Ein Schnitt zwischen dem linken Auge und der Basis des Ohres wird durchgeführt.
- Am Jochbogen und am Schuppenbein wird eine Kraniotomie durchgeführt.
- Die Arteria cerebri media wird mit einem kleinen Gefäßverödungsinstrument ligiert.
- Die Haut wird vernäht, um die Wunde nach dem Eingriff zu schließen.
Hauptergebnisse
- Infarkt lokalisiert in der linken Hemisphäre des Maushirns.
- Sichtbarmachung des Schlags durch TTC-Färbung oder MRT.
- Die Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der MCA-Ligatur-Technik.
- Hohe Reproduzierbarkeit der Infarktvolumina festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Die MCA-Ligation ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung fokaler zerebraler Ischämie.
- Erhöhte Überlebensraten tragen zur Validität der Befunde bei.
- Diese Technik kann zur weiteren Erforschung von Schlaganfalltherapien eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Modell der permanenten Mittelhirnarterien-Ligatur bietet ein reproduzierbares System zur Untersuchung fokaler zerebraler Ischämie und ermöglicht die mechanistische Absicherung neuroprotektiver Substanzen in der präklinischen Schlaganforschung. Durch die Erzeugung konsistenter Infarktvolumina bei Mäusen unterstützt diese Methode die Target-Validierung und Assay-Entwicklung für therapeutische Kandidaten, die ungedeckte medizinische Bedürfnisse beim ischämischen Schlaganfall adressieren. Ihre Relevanz für die menschliche Pathologie – bei rund 80 % der Schlaganfälle treten diese im Bereich der A. cerebri media auf – erhöht das Vertrauen in die Übertragbarkeit der Ergebnisse und die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten in der frühen Entdeckungsphase.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in ischämischen Signalwegen durch gezielte Induktion einer fokalen Ischämie.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die Beteiligung von Zielstrukturen an der Bildung des Infarktkerns und des Penumbra-Raums geklärt wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine reproduzierbare Quantifizierung des Infarkts mittels TTC-Färbung und damit eine konsistente Beurteilung der Zielstrukturenbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die Wirkstoff-Screening vor, indem ein krankheitsrelevantes Ischämie-Modell etabliert wird.
- Operativer Wert: Standardisiert die Infarkt-Messung mittels TTC-basierter Volumetrie und ermöglicht so eine quantitative Dosis-Wirkungs-Analyse.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays durch Überlebensraten von ~80 %, wodurch die Variabilität pharmakologischer Endpunkte verringert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die humane Schlaganfallpathologie mit hoher anatomischer und pathophysiologischer Relevanz für Infarkte im MCA-Gebiet.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung intrazellulärer Hypoxie-Antwortmechanismen in vivo und unterstützt die Entdeckung von Biomarkern.
- Operativer Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch standardisierte chirurgische und Färbeprotokolle.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung und bietet eine Plattform für die mechanistische Risikominderung von Schlaganfalltherapeutika.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung neuroprotektiver Zielstrukturen, indem kontrollierte ischämische Schädigungen und die Quantifizierung von Infarkten ermöglicht werden.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays durch standardisierte TTC-Färbung sicher und liefert quantitative Infarktvolumina zur Bewertung von Substanzen.
- Analytik: Erzeugt volumetrische Messungen (z. B. ca. 23 mm³ Infarkt nach 24 h), die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen und die Bestimmung der Effektgröße ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, da die Lokalisation der Infarkte menschlichen Schlaganfallmustern entspricht, was die risikoadjustierte Weiterentwicklung unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung mehrerer Substanzen in verschiedenen Projekten, dank ihrer Reproduzierbarkeit und standardisierter Endpunkte.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in ischämischen Signalwegen reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Verfahren für Kraniotomie, Ligatur und TTC-Färbung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung und Abbruch von Projekten, indem zuverlässige Infarktdaten bereitgestellt werden, wodurch biologische Risiken in späteren Phasen von Schlaganfallprogrammen verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung neuroprotektiver Kandidaten basierend auf konsistenten präklinischen Wirksamkeitssignalen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mikrochirurgie an Nagetieren und der neuroanatomischen Identifizierung der A. cerebri media.
- Benötigt mikrochirurgische Instrumente wie Gefäßkoagulatoren, Heizplatten und präzise Nähtechniken.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise im Team bezüglich Anästhesie, Analgesie und postoperativer Überwachungsprotokolle.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung der Techniken von Ratten- auf Mausmodelle, einschließlich der Nahtgröße und der Präzision der Okklusion.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit terminaler Endpunkte zur Quantifizierung des Infarkts mittels TTC-Färbung oder MRT.
