Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Für die zweidimensionale Gelelektrophorese eines Proteingemisches, das aus homogenisiertem Tumorgewebe gewonnen wurde, mit einem Puffer behandeln, der Chaotrope enthält, einem zwitterionischen Detergens und einem Reduktionsmittel. Chaotrope und Detergenzien denaturieren und lösen die Proteine auf. Reduktionsmittel reduzieren die Disulfidbindungen der Proteine, erzeugen freie Thiolgruppen und entfalten die Proteine für eine optimale Proteinauflösung.

Übertragen Sie die behandelte Proteinmischung in einen immobilisierten pH-Gradienten-Streifenhalter, IPG. Platzieren Sie einen IPG-Streifen mit linearem pH-Gradienten in der Acrylamid-Gel-Matrix. Fügen Sie Mineralöl hinzu, um die Verdunstung der Proteinlösung zu verhindern. Übertragen Sie den Halter in ein isoelektrisches Fokussierungssystem, IEF. Lassen Sie die Proteinlösung den Streifen rehydrieren.

Führen Sie IEF der ersten Dimension durch. Der elektrische Strom bewirkt, dass geladene Proteine durch den pH-Gradienten zu entgegengesetzt geladenen Elektroden wandern und an ihren jeweiligen isoelektrischen Punkten - dem pH-Wert, bei dem die Proteine keine Nettoladung haben, - immobilisieren.

Behandeln Sie den IPG-Streifen nach der IEF mit Natriumdodecylsulfat, SDS, einem anionischen Detergens, das Proteinen eine negative Ladung verleiht. Äquilibrieren Sie mit einem Alkylierungsmittel, um die Proteinthiolgruppen zu modifizieren und die Löslichkeit des Proteins während der Elektrophorese zu gewährleisten.

Laden Sie den Streifen auf ein vorgefertigtes, kleinporiges Polyacrylamid-Lösungsgel und befestigen Sie ihn mit geschmolzener Agarose. Füllen Sie die Kammern mit SDS-haltigem Elektrophoresepuffer. Initiieren Sie die elektrophorese in der zweiten Dimension, senkrecht zu IEF.

Negativ geladene, proteinreichere Proteine mit größerem Molekulargewicht bewegen sich durch das Gel langsam in Richtung der positiv geladenen Anode als kleinere Proteine, was eine größenbasierte Trennung erleichtert.

Färben Sie das Gel. Proteine können als diskrete Flecken auf dem Gel sichtbar gemacht werden.

Um dieses Verfahren zu starten, geben Sie 250 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten Proteinprobenlösung in jeden Schlitz eines 13 Zentimeter großen IPG-Streifenhalters. Legen Sie einen 18 Zentimeter großen IPG-Streifen mit der Gelseite nach unten auf jede Proteinprobenlösung und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Fügen Sie dann 3 bis 4 Milliliter Mineralöl hinzu, um jeden IPG-Streifen zu bedecken.

Montieren Sie als Nächstes jeden IPG-Streifenhalter zu einem isoelektrischen Fokussiersystem, wobei das spitze Ende auf der Rückplatte und das quadratische Ende auf der Frontplatte angebracht ist. Nachdem Sie die IPG-Streifen 18 Stunden lang bei Raumtemperatur rehydriert haben, stellen Sie die IEF-Parameter am isoelektrischen Fokussierungssystem mit einer Gesamtlaufzeit von 7,5 Stunden und 36.875 Voltstunden ein.

Nehmen Sie nach IEF jeden IPG-Streifen aus dem isoelektrischen Fokussiersystem und entfernen Sie das überschüssige Mineralöl mit einem unlöslichen Papiertuch. Wickeln Sie dann jeden Streifen in ein Blatt Plastikfolie und lagern Sie ihn bei -80 Grad Celsius.

Um ein 12%iges PAGE-Gel zu gießen, geben Sie doppelt destilliertes Wasser, 1,5 molaren Tris-Salzpuffer, 40% Acrylamid/Bisacrylamid-Stammlösung, 10% Ammoniumpersulfat und TEMED in ein Becherglas. Mischen Sie die Gellösung vorsichtig und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.

Gießen Sie die Gellösung vorsichtig in eine Multicasting-Kammer, bis zur erwarteten Gelhöhe von 19 Zentimetern. Geben Sie sofort etwa 3 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in die Multigießkammer, um jedes Auflösungsgel zu bedecken, und lassen Sie jedes Gel etwa eine Stunde lang polymerisieren.

Dieser Schritt ist sehr wichtig, um ein hochwertiges SDS-PAGE-Gel herzustellen. Jedes Gel muss sofort mit gleichem Volumen Wasser auffüllen.

Bereiten Sie zwei Liter Elektrophoresepuffer vor und geben Sie den Puffer in einen Puffertank der Elektrophorese-Trenneinheit.

Nachdem Sie die fokussierten IPG-Streifen aus dem Gefrierschrank genommen haben, legen Sie sie in ein Kunststoffgefäß mit 1 Milliliter reduzierendem Gleichgewichtspuffer und einer Spur Bromphenolblau und äquilibrieren Sie sie 10 Minuten lang unter leichtem Schaukeln. Nach Entfernen des reduzierenden Gleichgewichtspuffers werden 4 Milliliter Alkylierungsgleichgewichtspuffer und eine Spur Bromphenolblau zu den IPG-Streifen gegeben und 10 Minuten lang unter leichtem Schaukeln äquilibriert.

Während des Gelgleichgewichts zerlegen Sie die Multicasting-Kammer und entfernen Sie die vorbereitete auflösende Gelkassette. Spülen Sie die Gelkassette dreimal mit doppelt destilliertem Wasser aus, entfernen Sie dann überschüssiges Wasser mit einem unlöslichen Papiertuch aus der Gelkassette und legen Sie sie in einen Gelständer.

Spülen Sie anschließend die äquilibrierten IPG-Streifen mit Elektrophoresepuffer ab und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf jeder IPG-Streifenoberfläche mit einem unlöslichen Papiertuch. Legen Sie einen IPG-Streifen auf das auflösende SDS-PAGE-Gel, so dass die Kunststoffseite des IPG-Streifens mit dem spitzen Ende nach links mit der längeren Glasplatte in Kontakt kommt.

Fügen Sie nun schnell 3 bis 4 Milliliter heiße 1%ige Agarose und SDS-Elektrophoresepuffer hinzu, um den IPG-Streifen auf der Oberseite jedes SDS-PAGE-Gels zu versiegeln, und legen Sie die Oberseite des IPG-Streifens nach unten auf die Oberseite der kürzeren Glasplatte, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen entstehen.

Diese Schritte sind sehr wichtig, um den IPG-Streifen mit einem SDS-PAGE-Gel zu versiegeln. Die heißen Agaroselösungen müssen sofort hinzugefügt werden, und der IPG-Streifen muss sofort in die Oberseite des SDS-Gels eingebracht werden.

Nach der Polymerisation wird die zusammengebaute Gelkassette vertikal zwischen den Kunststoffdichtungen und einem vertikalen Elektrophoresesystem eingesetzt. Legen Sie die Oberseite des Gels mit dem IPG-Streifen neben die Kathode. Passen Sie als Nächstes den Gehalt an Elektrophoresepuffer an, um die Gelkassette einzutauchen, indem Sie dem Elektrophoresesystem das entsprechende Volumen Puffer hinzufügen.

Schließen Sie das Netzteil an und stellen Sie es in den Konstantspannungsmodus und lassen Sie es etwa 370 Minuten lang mit 200 Volt laufen, während Sie den Farbstoff überwachen. Nehmen Sie nach Beendigung des Laufs die Gelkassette aus dem Elektrophoresesystem und entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Gelkassette, wobei Sie darauf achten, dass das Gel nicht reißt.