Zymographie-Gelelektrophorese: Eine elektrophoretische Technik zum Nachweis von Matrix-Metalloproteinasen durch Bewertung der enzymatischen Aktivität

Die Matrix-Metalloproteinase (MMP), eine Multidomänenprotease, die Propeptid- und katalytische Domänen umfasst, wird als inaktives Enzym oder Zymogen von bestimmten Zellen sezerniert. Die Wechselwirkung zwischen dem Zinkion der katalytischen Domäne und dem Cysteinrest der Propeptiddomäne hält das MMP inaktiv.

Zum Nachweis von MMPs im Zellkulturüberstand durch Zymographie-Gelelektrophorese ist der Elektrophoresetank mit der Gelkassette mit Natriumdodecylsulfat oder SDS-haltigem Laufpuffer zu füllen.

Laden Sie den Kulturüberstand gemischt mit dem Beladungspuffer, gefolgt von Proteinstandards, in Vertiefungen aus Polyacrylamidgel, das mit einem MMP-spezifischen Proteinsubstrat copolymerisiert ist.

SDS, ein negativ geladenes Detergens, stört unter nicht reduzierenden Bedingungen die Cystein-Zink-Wechselwirkungen in MMPs und denaturiert die Proteine, während es eine negative Ladung verleiht.

Führen Sie eine Elektrophorese durch. Das elektrische Feld bewirkt, dass die negativ geladenen Proteine in Richtung der positiv geladenen Anode wandern, was zu einer größenbasierten Trennung der Proteine führt.

Behandeln Sie das Gel nach der Elektrophorese mit einem nichtionischen Detergensmittel, das Renaturierungspuffer enthält. Nichtionische Detergenzien ersetzen SDS, renaturieren Proteine und stellen die MMP-Aktivität teilweise wieder her. MMPs werden weiter in einen vollständig aktiven Zustand verarbeitet.

Inkubieren Sie in einem Entwicklungspuffer, der zweiwertige Metallkationen enthält, die für die MMP-Aktivität unerlässlich sind. Aktive MMPs verdauen zusammen mit Kationen das MMP-Substrat im Gel. Waschen Sie das Gel, um die verdauten Produkte zu entfernen. Färben Sie das Gel.

Die Bereiche der MMP-Aktivität, die frei von MMP-Substrat sind, erscheinen als klare Banden auf einem dunkelblauen Hintergrund aus unverdautem Substrat. Mit Hilfe einer geeigneten Software kann die Intensität der Gelbande mit der MMP-Aktivität korreliert werden.

Vor Beginn dieses Protokolls sind alle Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) ausreichend vorzubereiten, um die Funktion der Enzyme aufrechtzuerhalten. Die Proben können sofort verwendet oder bei -80 Grad Celsius gelagert werden. Hier wird MMP-2, auch bekannt als Gelatinase A oder Typ-IV-Kollagenase, verwendet, um die Visualisierung der MMP-Aktivität mit Hilfe der Zymographie zu demonstrieren.

Sobald die MMP-Enzyme hergestellt wurden, besorgen Sie sich einen 10%igen Gelatine-Zymogramm-Gelbeutel, der ein Gel in einer Kassette enthält. Spülen Sie die Kassette mit entionisiertem Wasser ab. Entfernen Sie das Schutzband von der Unterseite der Kassette und den Kamm von der Oberseite des Gels. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit Tris-Glycin SDS-Laufpuffer.

Legen Sie das Gel in ein Minizellen-Elektrophoresegerät und achten Sie darauf, dass die kleinere Seite der Kassette nach innen zeigt. Fixieren Sie das Gel mit dem Gel Tension Wedge. Füllen Sie die obere Kammer des Geräts mit Tris-Glycin SDS-Laufpuffer über dem Niveau der Vertiefungen und prüfen Sie, ob sie undicht sind. Füllen Sie auch die untere Kammer des Gelelektrophorese-Setups mit Laufpuffer

.

Laden Sie dann 10 Mikroliter molekularen Proteinmarker.

Mischen Sie die gleiche Menge der Probe mit einem Gelladepuffer, der keine Reduktionsmittel enthält. Im Gegensatz zu normalem SDS-PAGE kochen Sie die Proben nicht, sondern laden Sie sie direkt in die Vertiefungen des Gels, indem Sie Gelladespitzen verwenden. Diese Vertiefungen können bis zu 20 Mikroliter Volumen aufnehmen.

Setzen Sie den Deckel auf die Minizelle und schließen Sie die Elektrodenkabel an die Stromversorgung an. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie das Gel so ein, dass es 90 Minuten lang konstant mit 125 Volt läuft. Überprüfen Sie die Bildung kleiner Blasen auf dem Draht der unteren Kammer, die auf den Stromfluss hinweisen.

Wenn Sie das erste Gel ausführen, überwachen Sie den Fortschritt der Migration alle 15 Minuten, wobei Sie das im Ladepuffer enthaltene Bromphenolblau als Indikator verwenden. Bereiten Sie für jedes Gel 100 Milliliter 1X Zymogramm-Renaturierungspuffer und 200 Milliliter Zymogramm-entwickelnden Puffer vor, beide in deionisiertem Wasser.

Wenn der bromophenolblaue Tracking-Farbstoff den Boden des Gels erreicht, schalten Sie die Stromversorgung aus.

Öffnen Sie die Minizelle und entfernen Sie das Gel. Trennen Sie die beiden Seiten der Kassette mit einem Gelmesser. Schneiden Sie eine Ecke aus, um die Richtung des Gels zu markieren. Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und geben Sie es in einen Behälter mit 100 Millilitern Renaturierungspuffer.

Inkubieren Sie das Gel 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.

Entfernen Sie den Renaturierungspuffer und fügen Sie dem Gel 100 Milliliter Entwicklungspuffer hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.

Entfernen Sie dann den Entwicklungspuffer und fügen Sie dem Gel weitere 100 Milliliter frischen Entwicklungspuffer hinzu. Inkubieren Sie das Gel über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht den Entwicklungspuffer und waschen Sie das Gel, indem Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit entionisiertem Wasser unter leichtem Rühren inkubieren. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal.

Lege das Gel auf eine Plastikfolie und entferne die Blasen. Scannen Sie dann das Gel mit einem Fotoscanner, um die genaue Positionierung der Protein-Standardbanden zu speichern, da diese nach der Gelfärbung kaum sichtbar sind.

Färben Sie das Gel, indem Sie dem Gel 20 Milliliter SimplyBlue SafeStain hinzufügen. Inkubieren Sie das Gel 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.

Entfernen Sie den SimplyBlue SafeStain und entfärben Sie das Gel in 100 Millilitern entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.

Ersetzen Sie es nach 1 Stunde durch frisches deionisiertes Wasser und inkubieren Sie das Gel mindestens eine Stunde lang.