Zymographie-Gelelektrophorese: Eine elektrophoretische Technik zum Nachweis von Matrix-Metalloproteinasen durch Bewertung der enzymatischen Aktivität

Die Matrix-Metalloproteinase (MMP), eine Multidomänenprotease, die Propeptid- und katalytische Domänen umfasst, wird als inaktives Enzym oder Zymogen von bestimmten Zellen sezerniert. Die Wechselwirkung zwischen dem Zinkion der katalytischen Domäne und dem Cysteinrest der Propeptiddomäne hält das MMP inaktiv.

Zum Nachweis von MMPs im Zellkulturüberstand durch Zymographie-Gelelektrophorese ist der Elektrophoresetank mit der Gelkassette mit Natriumdodecylsulfat oder SDS-haltigem Laufpuffer zu füllen.

Laden Sie den Kulturüberstand gemischt mit dem Beladungspuffer, gefolgt von Proteinstandards, in Vertiefungen aus Polyacrylamidgel, das mit einem MMP-spezifischen Proteinsubstrat copolymerisiert ist.

SDS, ein negativ geladenes Detergens, stört unter nicht reduzierenden Bedingungen die Cystein-Zink-Wechselwirkungen in MMPs und denaturiert die Proteine, während es eine negative Ladung verleiht.

Führen Sie eine Elektrophorese durch. Das elektrische Feld bewirkt, dass die negativ geladenen Proteine in Richtung der positiv geladenen Anode wandern, was zu einer größenbasierten Trennung der Proteine führt.

Behandeln Sie das Gel nach der Elektrophorese mit einem nichtionischen Detergensmittel, d